心肌營養素-1對抗NMDA受體腦炎致海馬神經元損傷的保護作用

李振宏 黃濤

【摘要】 目的：研究營養素-1（CT-1）干預治療抗N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體腦炎誘導的神經元損傷的保護作用及機制，為抗NMDA受體腦炎提供新的治療靶點。方法：選擇剛出生的SD大鼠培養原代神經元細胞，把原代神經元細胞分為實驗組﹑對照組和正常組，分別建立抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型，在實驗組中加入CT-1（10 ng/mL），應用臺盼藍染色法、免疫組織化學和TUNEL細胞凋亡檢測等技術，檢測CT-1對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用以及細胞凋亡基因Caspase-3表達水平。結果：各種濃度的谷氨酸均能誘導神經元凋亡，谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率高而死亡率并不高;加入CT-1神經元細胞，第1、2、3天，實驗組細胞存活率均高于對照組，細胞凋亡率、Caspase-3陽性細胞率均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：CT-1對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷有保護作用，可能是通過促使凋亡基因Caspase-3表達下調，減少細胞凋亡發生，從而對抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷起到保護作用。

【關鍵詞】 抗NMDA受體腦炎; 神經元; 損傷; 心肌營養素-1

【Abstract】 Objective：To study the protective effect and mechanism of cardiotrophin-1（CT-1）intervention on neuronal injury induced by anti-NMDA-receptor encephalitis and to provide a new therapeutic target for anti-NMDA-receptor encephalitis.Method：The primary neuron cells were cultured in newly born SD rats，they were divided into experimental group，control group and normal group，neuronal injury models induced by anti-NMDA-receptor encephalitis were established，CT-1（10 ng/mL）was added to experimental group.Trypan blue staining，immunohistochemistry and TUNEL cell apoptosis detection were used to detect the protective effect of CT-1 on neuronal injury induced by NMDA receptor encephalitis and the expression level of Caspase-3.Result：All concentrations of glutamate could induce neuronal apoptosis，when the concentration of glutamate was 100 and 200 μmol/L，the apoptotic rate was high and the mortality rate was not high.On the 1st，2nd and 3rd day after adding CT-l neurons，the survival rate of experimental group were higher than those of control group，and the apoptotic rate and Caspase-3 positive cell rate were lower than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CT-1 has protective effect against neuronal injury induced by anti-NMDA-receptor encephalitis，which may be through down-regulation of Caspase-3 expression and reduction of apoptosis，thereby protecting neurons from NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury.

【Key words】 Anti-NMDA-receptor encephalitis; Neuron; Injury; Cardiotrophin-1

First-authors address：Ganzhou Hospital Affiliated to Nanchang University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.006

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體腦炎是一種起病時臨床表現不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經系統疾病，心肌營養素-1（cardiotrophin-1，CT-1）是Pennica等于1995年發現的一種細胞因子，與睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、白介素6等同屬促神經生長因子家族[1-2]。近年來發現CT-l對中樞神經系統有重要作用，可通過其特異性受體對神經元起保護作用[3-5]。本研究針對抗NMDA受體腦炎的發病機制，通過建立抗NMDA受體腦炎體外培養模型，觀察CT-1對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用，了解CT-1對神經元的作用和機制，為抗NMDA受體腦炎的臨床研究提供新的靶點。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇剛出生的SD大鼠，進行原代神經元細胞培養。

1.2 方法

1.2.1 原代神經元培養 選擇剛出生的SD大鼠，用眼科鑷取出海馬，D-Hanks液清洗后，剪成1 mm3左右的小塊，在37 ℃溫度下用0.25%胰蛋白酶消化組織小塊后，調節細胞懸液濃度為1×106/mL，接種于經0.01%多聚賴氨酸預處理的細胞培養瓶中。神經元細胞培養9 d后，經過NF-200免疫細胞組織化學法鑒定，神經元占培養細胞的90%以上。

1.2.2 建立抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型 當神經元細胞培養至第9天，隨機選取60個標本為實驗1組，15個樣本為對照1組，將實驗1組均分為4個小組，分別加入不同濃度谷氨酸（100、200、300、400 μmol/L），對照1組不加任何藥品處理，實驗1組中不同濃度的谷氨酸與神經元細胞作用15 min后更換新鮮培養液，24 h后進行臺盼藍染色和TUNEL細胞凋亡檢測。（1）臺盼藍染色檢測細胞存活率：神經元細胞經臺盼藍染色后，隨機計數15個視野中藍染神經元數，死亡細胞被染成藍色，未著色的細胞為存活細胞。神經元存活率=神經元存活數/細胞總數×100%。（2）TUNEL檢測細胞凋亡率：神經元細胞經TUNEL檢測，隨機計數15個視野中深棕色神經元數，凋亡細胞被染成深棕色，未著色的細胞為存活細胞。神經元凋亡率=神經元凋亡數/細胞總數×100%。

1.2.3 CT-1對抗NMDA受體腦炎誘導神經元損傷的保護作用 另隨機選取原代神經元細胞45個標本，將其均分為實驗組﹑對照組和正常組，各15個標本。實驗組在加谷氨酸前1天加入CT-1（10 ng/mL），對照組中加入相同劑量緩沖液，正常組不做處理。當神經元細胞培養至第9天，將低濃度谷氨酸（100 μmol/L）加入實驗組和對照組中，15 min后換回正常細胞培養液，正常組不加入谷氨酸。繼續培養細胞至1﹑2、3 d進行細胞存活率、凋亡率和細胞凋亡基因Caspase-3表達水平。Caspase-3基因表達檢測：采用免疫組化方法檢測Caspase-3基因表達，隨機計數15個視野中陽性神經元數和總神經元數，神經元中有棕色著色者為陽性神經元，Caspase-3基因陽性表達率=陽性神經元數/神經元總數×100%。

1.3 統計學處理 使用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代神經元培養和鑒定 神經元細胞接種細胞培養瓶后，可見細胞為懸浮在培養液中的小圓形細胞，邊界清楚，細胞密度很高;1 d后在培養瓶壁上可見大多數細胞基本貼壁，少數細胞可見軸突生長，軸突長度約占細胞體的一半;2 d后大多數細胞有軸突生長，長度約為胞體的2～3倍;3 d后神經元細胞胞體變大，軸突長度增長不明顯;第4～5天可見許多細胞碎片，為崩解的神經膠質細胞;培養第8天，軸突逐漸增長，彼此相互連接，形成網狀，見圖1;細胞培養第9天，免疫組織化學鑒定神經元，神經元細胞及其軸突被染成棕色，棕色陽性細胞占全部細胞的90%以上，見圖2。

2.2 抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷模型分析 臺盼藍染色發現，不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞6 h后，可見部分細胞胞體腫脹，細胞軸突變短，1 d后部分腫脹細胞裂解;TUNEL染色發現，不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞1 d后，神經元細胞體積變小，細胞核固縮;各種濃度的谷氨酸均能誘導神經元凋亡，實驗1組不同濃度谷氨酸組細胞存活率均低于對照1組，凋亡率均高于對照1組，差異均有統計學意義（P<0.05），且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經元細胞的存活率逐漸下降，細胞凋亡率逐漸上升，差異均有統計學意義（P<0.05），其中谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而升高，而濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而下降，見表1和圖3、4。

2.3 CT-1對神經元的保護作用

2.3.1 細胞凋亡率、存活率比較 當神經元細胞培養至第9天，加入100 μmol/L谷氨酸誘導凋亡后，TUNE檢測顯示：第1、2、3天，正常組細胞凋亡率均低于實驗組和對照組，且實驗組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）;臺盼藍染色顯示：第1、2、3天，正常組細胞存活率均高于實驗組和對照組，且實驗組均高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2、圖5～9。

2.3.2 Caspase-3基因表達情況分析 細胞免疫組化技術檢測Caspase-3蛋白在神經元細胞中的表達情況，Caspase-3陽性細胞可見神經元胞漿和軸突著色;凋亡后第1、2、3天，正常組Caspase-3陽性細胞率均低于實驗組和對照組，且實驗組均低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3和圖10、11。

3 討論

抗NMDA受體腦炎是一種起病時臨床表現不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經系統疾病，主要累及人體大腦邊緣系統，典型臨床表現以精神異常與癲癇發作為特征，其中大多數病人由腫瘤、感染等引起[6-12]。抗NMDA受體腦炎的發病機制迄今尚未完全闡明，目前大部分學者認為該病是抗NMDA抗體介導的免疫損傷所致，NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，由多種亞基組成的異四聚體，屬電壓門控通道，大量存在于大腦神經細胞中，其中主要分布在大腦海馬區等邊緣系統，功能主要是調節突觸傳遞及促發突觸重塑，異常激活常導致驚厥發作、精神異常等臨床表現[13-17]。

本研究在神經元細胞培養至第10天，當神經元發育成熟，細胞狀態良好時，用不同濃度的谷氨酸作用于神經元細胞，檢測細胞凋亡率，結果顯示，各種濃度的谷氨酸均能誘導神經元凋亡，實驗1組不同濃度谷氨酸組細胞凋亡率均高于對照1組，且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經元細胞凋亡率逐漸上升，差異均有統計學意義（P<0.05），其中谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而升高，而濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時，細胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而下降。而且本研究結果顯示，實驗1組不同濃度谷氨酸組細胞存活率均低于對照1組，且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經元細胞的存活率逐漸下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。由于谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時，細胞凋亡率高而細胞死亡率并不高，提示100﹑200 μmol/L的谷氨酸為誘導神經元凋亡的最佳濃度。在證實了低濃度的谷氨酸可引起神經元凋亡之后，筆者在使用谷氨酸誘導神經元凋亡的前1天，在實驗組神經元細胞中加入CT-1，然后采用TUNEL檢測和臺盼藍染色等方法來評價CT-1對神經元的保護作用，結果顯示，第1、2、3天，正常組細胞凋亡率均低于實驗組和對照組，且實驗組低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），正常組細胞存活率均高于實驗組和對照組，且實驗組均高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），說明加入了CT-1的實驗組細胞存活率明顯高于對照組，而細胞凋亡率卻明顯低于對照組，提示CT-1對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷具有抑制作用，對神經元具有保護作用。而其對神經元的保護作用，可能主要是通過抑制凋亡的途徑來實現的。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執行分子，其在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮作用。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[18-20]。在抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的機制中，為探究有無Caspase-3的參與，而CT-1對其表達有無抑制作用，筆者作了Caspase-3免疫組化，結果顯示：凋亡后第1、2、3天，正常組Caspase-3陽性細胞率均低于實驗組和對照組（P<0.05），提示谷氨酸損傷使Caspase-3蛋白表達增加，Caspase-3參與了抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的機制;實驗組Caspase-3蛋白表達低于對照組（P<0.05），提示CT-1可抑制Caspase-3蛋白表達，因此其抑制凋亡的作用可能與抑制Caspase-3蛋白表達有關。

綜上所述，本研究提示低濃度谷氨酸可作為抗NMDA受體腦炎導致的神經元凋亡的良好模型，CT-1對抗NMDA受體腦炎導致的神經元損傷有保護作用，可能是通過促使凋亡基因Caspase-3表達下調，減少細胞凋亡發生，從而對抗NMDA受體腦炎誘導的神經元損傷起到保護作用。

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（收稿日期：2018-08-13） （本文編輯：董悅）