TLR4受體在妊娠期缺氧子代大鼠動脈粥樣硬化的研究

蔣海彬

【摘要】 目的：在妊娠期缺氧子代SD大鼠應用脂多糖，以研究TLR4受體在動脈粥樣硬化中的作用。方法：將20只鼠齡8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分為兩組（G2）和（G4），每組10只，分別給予腹腔注射生理鹽水（等容積）或脂多糖（2.5 mg/kg），將20只妊娠期缺氧空白對照雄性子代大鼠（G1）和（G3）作相應處理，每周2次，連續注射8周。于12月齡后處死大鼠。采用ELISA檢測大鼠血清中炎癥相關因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平，Real time-PCR檢測大鼠主動脈組織中NF-κB p65與TLR4 mRNA表達。結果：G3和G4組炎癥相關因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05），主動脈組織中TLR4、NF-κBp65 mRNA的表達明顯升高（P<0.05），并且G4最高（P<0.05）。結論 脂多糖可以引起主動脈炎癥反應。通過TLR4/NF-κB信號途徑的激活，TLR4受體在動脈粥樣硬化中起到了重要的作用。

【關鍵詞】 Toll樣受體4; 動脈粥樣硬化; 核因子-κB; 妊娠期缺氧

【Abstract】 Objective：To investigate the pathologic mechanisms of TLR4 in atherosclerosis after TLR4 agonists（LPS）were administered to offspring rats from hypoxia during pregnancy.Method：Twenty female offspring rats from hypoxia during pregnancy aged 8 months were randomized into two groups（G2）and（G4）with 10 in each group. Saline（isovolumic normal saline）and LPS（2.5 mg/kg）were administered respectively by intraperitoneal injection，twice a week. Corresponding interventions were given to offspring rats（G1）and（G3），from control group during pregnancy and compared with offspring rats from hypoxia during pregnancy. After treatment 8 weeks，the ELISA was used to measure the IFN-γ，TNF-α，IL-1β of serologic inflammatory cytokines，and the real time-PCR was used to measure the TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in aortic sinus specimens aortic sinus.Result：The levels of immune inflammatory mediators（IFN-γ，TNF-α，IL-1β）rose significantly in group G3 and G4（P<0.05）. Simultaneously，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in the aorta tissue of group G3 and G4 were enhanced（P<0.05）.In addition，the above-mentioned parameters were more obvious in group G4（P<0.05）.Conclusion：Inflammatory response occurred in the aorta tissue in rats after LPS exposure. TLR4 receptor revealed an important role in inflammatory injury of the aorta tissue after LPS stimulation by the activation of TLR4/NF-κB signal pathway.

【Key words】 Toll-like receptor 4; Atherosclerosis; Nuclear factor-kappa B; Hypoxia during pregnancy

First-authors address：NO.2 Hospital Affiliated to Xiamen Medical College，Xiamen 361000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.002

目前，心血管疾病等慢性病對人類健康造成了重大影響，既往大量研究表明吸煙、高血壓、肥胖等為其確定的危險因素，但上述原因并不能完全解釋心血管疾病的流行。有研究表明，在排除后天社會行為的因素的前提下，產前營養不良、出生體重低、產后營養狀況與冠心病也存在較強的相關性[1]，上述研究表明產前與早期出生后相關因素也是心血管疾病的危險因素。作為心血管疾病的主要病理生理學基礎，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認為是一種“炎性疾病”。炎癥伴隨著AS的發展，其一個常見特征是細胞因子上調。作為一組Ⅰ型跨膜模式識別受體（transmembrane pattern-recognition receptors，PRRs）[2]，Toll樣受體是（Toll-like receptors，TLRs）的特異配體包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。當細胞受LPS刺激時，LPS-LPS結合蛋白（LBP）復合物結合到細胞表面CDl4/TLRs受體，通過髓樣分化蛋白88（Myeloid differentiation protein 88，MyD88）依賴或非依賴MyD88信號轉導途徑，激活核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）和活化蛋白激酶信號通路進而各種炎性細胞因子基因表達上調[3-4]，炎性介質水平上調[5-6]。本研究旨在通過對妊娠期缺氧子代Sprague-Dawley（SD）大鼠腹腔注射LPS，觀察血中炎癥因子[主要包括白介素IL-1β（interleukin1 IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和干擾素-（Interferon-γ，IFN-γ）]、TLR4及下游NF-B在主動脈中的表達，以研究LR4受體在AS中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型

1.1.1 對象 健康清潔級雄性SD大鼠24只（16周齡，體重360～400 g），健康清潔級雌性SD大鼠24只（12周齡，體重200～250 g），均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將雄雌大鼠按1：1比例隨機合籠，妊娠期缺氧及空白對照下所孕育子代SD雄性大鼠。

1.1.2 實驗設計 本研究的研究因素是妊娠期缺氧和子代大鼠成年后腹腔注射LPS，研究其對AS的影響。實驗采用完全隨機分組的兩因素兩水平析因設計，子代雄性大鼠共分四組，正常組（G1）、妊娠期缺氧組（G2）、腹腔注射內毒素組（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射內毒素組（G4），每組10只，窩別、鼠齡、體重、動物飼養等因素匹配。

1.1.3 實驗方法

1.1.3.1 建立妊娠期缺氧模型 將雄雌大鼠按1︰1比例隨機合籠，采用托盤法每半天檢查1次是否有陰栓，發現陰栓為妊娠第0天。然后將妊娠大鼠隨機分為兩組，即分別于妊娠第1天開始缺氧和空白對照組，每組各6只。將妊娠大鼠分批置入缺氧箱內，氮氣和氧氣分別通過四個進氣孔通入（每種兩孔），內置小電扇將輸入的氣體不斷混勻，出氣通路使用單向活瓣，箱內外大氣壓通過箱體預留小縫隙與箱外大氣相通從而保持平衡。同時在箱內放置堿石灰和氯化鈣（用于吸收CO2和水蒸氣）。維持箱內溫度19～23 ℃，濕度64%～68%，CO2濃度<3%，將箱內氧氣濃度控制于（10±1）%（通過S-450型氧氣檢測報警儀監測以實時調節氮氣和氧氣的流量）。于箱體內處理3 h后取出動物，每天重復上述過程直至大鼠分娩。對照組孕鼠置于同樣的缺氧箱內，持續通入空氣，保持箱內與箱外氧濃度一致，處理時間與缺氧組相同。

1.1.3.2 建立腹腔注射內毒素動物模型 對鼠齡、窩別、體重等因素進行匹配后，隨機取上述孕鼠子代雄性大鼠，體重300～350 g，鼠齡8月，共分四組，正常組（G1）、妊娠期缺氧組（G2）、腹腔注射內毒素組（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射內毒素組（G4），每組10只。將 20只鼠齡8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分為兩組（G2）和（G4），分別給予腹腔注射生理鹽水（等容積）或脂多糖（2.5 mg/kg，250 μg/mL）（sigma公司，美國），將20只妊娠期缺氧空白對照雄性子代大鼠（G1）和（G3）進行相應處理并做比較，每周兩次，連續注射8周。在相同條件下飼養，共持續8周，喂養至12月齡。大鼠的飼養及處理經過福建醫科大學動物關懷與應用委員會的批準。

1.2 留取大鼠血及組織標本 于12月齡，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30～45 mg/kg）麻醉后，分離腹主動脈，插管采集血液標本，測相關指標。截取整段胸腹主動脈，置于凍存管中液氮中速凍，轉入-80 ℃冰箱待測。

1.3 ELISA檢測IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平應用ELISA試劑盒干擾素-（IFN-γ，上?？祈樕锟萍加邢薰荆?、腫瘤壞死因子（TNF-α，南京森貝伽生物科技有限公司）和白介素IL-1β（IL-1β，上海遠慕生物科技有限公司）檢測血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平。

1.4 實時PCR檢測TLR4、NF-κB p65的mRNA水平 主動脈組織提取總RNA。根據cDNA合成試劑盒將5 μg總RNA逆轉錄為cDNA（Takara公司，日本）。使用實時PCR試劑盒（Takara公司，日本）進行擴增，實時PCR反應體積20 μL，其中cDNA2 μL，上下游引物各0.4 μL，實時PCR試劑10 μL，去離子水7.2 μL，陰性對照組以雙蒸水代替模板。標準曲線內參為GAPDH。引物序列：TLR4上游引物（5-ATGTTGTGGCTACTATAGGC-3）、下游引物（5-GGCCACTTTCGTGACTTCGAA-3）;NF-κB p65上游引物（5-TCCTTCTCGCGTGACAATCGA-3）、下游引物（5-ATTGGATCTAAGG GATCACGC-3）;內參GADPH上游引物（5-AGACTGTCGTCCGTGGA CTCG-3）、下游引物（5-TGGGGCCAGAGAGGTCATTCCCA-3）。PCR反應條件：95 ℃ 30 s，循環1次;變性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環共40次;65 ℃ 10 s，循環1次。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件進行處理，血炎性因子與主脈組織內mRNA表達等定量數據以（x±s）表示，采用單因素方差分析進行比較，多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各大鼠一般情況及主動脈切片情況 妊娠期缺氧組出現出生低體重后追趕生長，至5月齡時，體重已無區別。注射生理鹽水的各對照組大鼠飲食與活動良好，無意外及死亡，毛發光滑;注射LPS組大鼠未出現死亡，但活動明顯遲滯，毛發紊亂、精神萎靡。對實驗對象主動脈根進行切片染色顯示，只有妊娠期缺氧子代大鼠LPS組主動脈根部內膜增厚，部分斑塊形成，不同程度的炎細胞浸潤于血管外膜。

2.2 各組血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β濃度比較 ELISA檢測結果顯示，經LPS作用后，G3和G4組IFN-γ、TNF-α、IL-1β表達水平血清水平較鹽水組明顯升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）組最高（P<0.05）。見表1。

2.3 主動脈組織TLR4和NF-κB p65 mRNA的表達水平 實時定量PCR檢測結果顯示，經LPS作用后，G3和G4組TLR4和NF-κB p65 mRNA表達水平較鹽水組明顯升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）組最高（P<0.05）。見表2。

3 討論

AS是一種“炎癥性疾病”，血管內膜炎性損傷及修復參與了AS的形成過程。體內多種細胞通過相關因子相互作用，促進了AS的發生發展，TLRs在其中起著重要作用。機體可通過免疫細胞表面的TLR識別病原相關分子模式（主要包括LPS和脂磷壁酸、膜脂蛋白、糖脂肽和某些病毒DNA等）。TLRs與配體結合后通過信號轉導途徑激活NF-κB，影響細胞因子的合成與釋放，促進或抑制炎癥。TLR4特異性地識別LPS，是LPS誘發炎性反應的關鍵[7]，是LPS激活NF-κB的上游機制[8]，能夠持續誘導NF-κB的活性，上調炎癥因子，介導誘發炎性反應[9-10]。LPS可直接作用于TLR4受體，上調其表達[11]，也可作用于細胞表面的CD14，通過LPS/CD14復合物[12]，上調TLR4受體的表達，其表達量與促炎性介質的釋放量有關[13]。TLR4表達上調可大量激活NF-κB，NF-κB即可由胞質進入細胞核，啟動多種細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-1β）基因的轉錄和翻譯，從而誘導炎性細胞激活[14]。

慢性心血管疾病病理生理過程中存在性別差異，雌性可能存在保護作用，故本研究中把研究對象設為雄性子代大鼠。妊娠期缺氧與子代出生低體重有關，在本研究中也得以體現。當條件恢復后生長抑制大鼠出現追趕生長（代償性的快速生長）。本研究妊娠期缺氧組3月齡前的追趕生長比較明顯，至5月齡時，體重已無差別。本研究結果中，經LPS作用后，G3和G4組主動脈組織TLR4和NF-κB p65 mRNA及血清學IFN-γ、TNF-α和IL-1β 表達水平較鹽水組明顯升高（P<0.05）;且宮內缺氧LPS組G4最高（P<0.05），證明LPS能夠刺激主動脈組織等細胞TLR4，進而激活NF-κB信號通路，啟動IFN-γ、TNF-α和IL-1β細胞因子基因轉錄，從而誘導炎性細胞激活同時，展示了TLR4通路介導的炎癥損傷，提示脂多糖在妊娠期缺氧模型中較容易誘導AS，表明妊娠期缺氧是AS的危險因素，但不一定單獨致病，而是在后天環境刺激過程中得以體現。TLR4通路在AS與宮內缺氧的關系中可能起到了橋梁及加速的作用。LPS引起的人類血管外膜成纖維細胞的脂質沉積主要是通過TLR4/NF-κB通路實現[15]。TNF-α通過激活NF-B信號通路在AS中起作用。細胞中的NF-κB在未受到活化時不具有相關功能。此時，被結合的NF-κB P65亞基覆蓋P50亞基的核定位信號，蛋白復合體被“囚禁”在細胞質中，轉錄調節作用無法發揮[16]。當細胞受到LPS等細胞外信號刺激時，蛋白激酶被激活，致使結合在NF-κB P65亞基上的蛋白N端調節區Ser32/36磷酸化，然后該區內的兩個賴氨酸殘基結合泛素蛋白，受蛋白酶小體的作用而裂解，NF-κB獲得了自由，迅速從細胞質轉移至細胞核[17]。在體內，NF-κB的活化過程受到精細調控，會與其他炎癥信號轉導通路有交匯作用，其主要的調節方式為反饋調控。具體有兩種調節途徑：（1）正反饋調節（細胞內），TNF-α和IL-1β轉錄基因受活化后的NF-κB增強，從而釋放大量TNF-α和IL-1β，最后NF-κB被激活;（2）負反饋調節（細胞內外），在胞內，NF-κB可特異識別其抑制蛋白基因順式作用元件，調控其抑制蛋白轉錄，NF-κB活化后，其抑制蛋白轉錄亦被上調，在胞外，負向調節細胞因子IL-10受LPS、TNF-α和IL-1β的刺激而大量出現，然后內毒素誘導的NF-κB活化被IL-10阻斷，促炎細胞因子受到抑制，急性炎癥反應中斷[18-20]。本研究中，妊娠期缺氧在追趕生長中，可能存在炎癥反應及其正反饋調節，而在受到LPS刺激后，易受激發。

本研究腹腔內注射LPS致AS發病過程中，LPS通過TLR4/NF-κB 途徑引起血管炎癥反應，即激活TLR4，活化NF-κB ，誘發炎性因子，趨化炎性細胞至血管內皮下，最終導致AS的形成和發展，為AS始于血管內皮損傷之學說提供佐證，在跨膜信號轉導通路的“源頭”水平上進一步認識AS發病機制。AS的形成和發展中，各種交匯作用非常廣泛和復雜，并且不同的細胞和不同的狀態時效應有所不同，其精確的相互作用及調控機制仍然是重要的研究方向。

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