重組人白介素35質粒的構建及鑒定

顧香 陳吉泉 李兵

【摘要】 目的：通過分子生物學技術構建重組人白介素35（IL-35）質粒，為進一步研究人IL-35的生物學功能奠定基礎。方法：用KG-1細胞（人白血病細胞）擴增p35和EBI3的cDNA，將兩者先后連接至pSectag2A質粒中，最后把Linker連接至pSectag2A-p35-EBI3中，構建成pSectag2A-IL-35質粒。結果：經測序等方法鑒定重組質粒中p35和EBI3序列與Genbank中（p35 NM-000882和EBI3 NM-005725）公布的序列一致。結論：成功構建pSectag2A-IL-35真核表達載體。

【關鍵詞】 重組; PCR; IL-35; 質粒

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.078 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）17-0-03

【Abstract】 Objective：To construct recombinant human IL-35 expression vector by molecular biology technique，which could lay a foundation for further study of the biological function of IL-35.Method：EBI3 and p35 were amplified by PCR from the cDNA library derived from the KG-1 cells.And they were cloned into pSectag2A vector.Finally Linker was cloned into pSectag2A-EBI3-p35，and pSectag2A-IL-35 plasmid was successfully reconstructed.Result：The pSectag2A-IL-35 vector was verified by DNA sequencing，whose sequencing were consistent with those published in Genbank（EBI3 nm-005725，p35 nm-000882）.Conclusion：Psectag2a-IL-35 eukaryotic expression vector is successfully constructed.

【Key words】 Recombinant; PCR; IL-35; Plasmid

First-authors address：Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

IL-35是白介素12家族的一員，1997年Devergne等[1]報道了IL-35是由白介素12的p35亞基（IL-12 p35，即p35）和EB病毒誘導基因3（EBI3）構成。p35及EBI3基因編碼分子量分別為35、34 kD的糖蛋白[2]。2007年Collison等[3]經小鼠體內實驗初步證實，調節性T細胞（Treg細胞）可高表達EBI3和p35，且兩者的二聚體能加強Tregs的免疫抑制功效。2007第13屆免疫學國際會議上，由Vignali首次提議該二聚體命名為IL-35，最后成功獲批。自此，IL-35就成為免疫學、分子生物學等領域研究的熱點。本實驗擬構建人IL-35質粒，為深入研究IL-35的生物學作用及其機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和質粒 人白血病細胞株KG-1由華東理工大學代同成博士惠贈，pSectag2A載體由英國格拉斯哥大學Wei Xiaoqing教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ，DL2000 Marker、T4DNA連接酶、質粒抽提試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）、T載體（TAKARA）、DNA膠回收試劑盒、RNA提取試劑。

1.1.3 培養基 DMEM高糖培養基購自GIBICO公司，Hyclone胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 p35和EBI3 cDNA的克隆 按照p35和EBI3在NCBI的GenBank中的cDNA序列，利用Primer Premier 5軟件設計引物。依照pSectag2A質粒圖譜，篩選酶切位點。在EBI3上游引物的5端加上4個保護堿基并引入HindⅢ酶切位點：AAAGAAGCTTTGCCCGCCCTGCAGTGGA，EBI3下游引物的5端加上5個保護堿基并引入EcoRⅠ及NotⅠ酶切位點：ATTAAGAATTCGCGGCCGCGCCCAGGCTCATTGTGG;在p35上游引物的5端加上10個保護堿基并引入NotⅠ酶切位點：ATATTAGAATGCGGCCGCAACCTCCCCGTGGCCAC，p35下游引物的5端加上4個保護堿基并引入XhoⅠ酶切位點：GGCCCTCGAGGGAAGCATTCAGATAGCTCAT;Linker引物均引入NotⅠ酶切位點，HLS：GGCCGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGC，HLA：GGCCGCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGC。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 KG-1細胞RNA的提取及PCR擴增目的片段 用PBS沖洗細胞2遍，按每106個細胞加入1 ml的Trizol，將細胞輕輕沖洗下來，收集至1.5 ml離心管中，隨后加入200 μl氯仿，經過劇烈震蕩，4 ℃，13 000 r/min離心15 min，可分3層，上層為RNA水相，將其吸出并加入500 μl異丙醇，冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml預冷的用DEPC水配制的75%乙醇，混勻后4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入30 μl的焦碳酸二乙酯水溶解。

把上述RNA逆轉錄合成cDNA文庫，逆轉錄-聚合酶鏈反應的反應體系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，Total RNA 7 μl，RNase Free 1 μl;反應參數：37 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。

以上述引物為引物，將逆轉錄獲得的cDNA為模板，擴增目的基因。PCR反應參數：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環;72 ℃ 5 min。擴增產物EBI3、p35去掉信號肽序列、起始及終止密碼子，大小為642 bp及591 bp。

1.2.3 IL-35-pSectag2A重組真核表達載體的構建 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并照相回收目的片段。將膠回收的產物EBI3及p35連接到T載體上，轉化DH5α感受態細胞，挑取單克隆于3 ml LB培養基中，37 ℃，120 r/min培養過夜。提取質粒，對EBI3利用HindⅢ、EcoRⅠ進行雙酶切，用T4連接酶將酶切的目的片段和同樣酶切的pSectag2A載體片段分別進行黏性末端的連接，轉化培養，提取質粒，經PCR鑒定后測序。

測序正確后，將p35經NotⅠ、XhoⅠ雙酶切，用T4連接酶將酶切的目的片段和同樣酶切的pSectag2A-EBI3載體片段進行連接，轉化培養，抽提質粒，經PCR鑒定后測序。

若測序正確，以退火反應獲得Linker。退火體系：LinkerS：5 μl，LinkerA：5 μl，Buffer：10 μl，ddH2O：80 μl。退火參數：90 ℃ 5 min，37 ℃ 1 h。在退火產物中加入100 μl ddH2O，并加入600 μl無水乙醇，混勻后放入-20 ℃冰箱過夜，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，待酒精揮發完后加入20 μl ddH2O，混勻后與經NotⅠ單酶切的pSectag2A-EBI3-p35載體連接，轉化培養，抽提質粒，經PCR鑒定后測序。

2 結果

2.1 p35和EBI3基因的克隆

通過逆轉錄-聚合酶鏈反應擴增獲得p35、EBI3基因片段，RT-PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳后可見大小約為591 bp及642 bp的條帶，所獲條帶與預期大小相符（圖1），可將其連接至pUCm-T載體。

2.2 pUCm-T-EBI3、pUCm-T-p35的酶切產物

RT-PCR產物EBI3與pUCm-T連接，同時與pSectag2A經HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切;p35與pUCm-T連接，并與pSectag2A-BBI3經NotⅠ、XhoⅠ雙酶切。上述酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。圖2中1泳道為DL 2000 DNA Marker，2泳道顯示大小兩條帶，其中小片段大小與預期大小相符（591 bp）;3泳道所顯示條帶的大小與預期大小相符（5 707 bp）;4泳道為10 000 bp DNA Marker，5泳道顯示一條帶，其大小與理論值（6 349 bp）一致，6泳道顯示大小兩條帶，其中小片段大小與預期大小相符（642 bp），最后將目的片段p35和EBI3切膠回收，分別與pSectag2A及pSectag2A-EBI3連接。

退火獲得Linker產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。圖3中2泳道顯示一條帶，大小與理論值（51 bp）相符，未見其他非特異性條帶。

EBI3及p35片段先后連接至pSectag2A構成重組質粒pSectag2A-EBI3-p35，經過NotⅠ單酶切的產物，隨后經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。圖3中4泳道顯示的條帶為線性化的pSectag2A-EBI3-p35載體，大小與理論值（6 349 bp）相符，切膠回收目的條帶，最后與Linker連接。

2.3 重組IL-35-pSectag2A真核表達載體的鑒定。

以HES、HEA為引物PCR鑒定重組載體pSectag2A-EBI3，結果示圖4中2、4、5泳道顯示一條帶，大小與理論值（642 bp）一致，表明pSectag2A與目的片段EBI3連接成功。用測序引物T7/BGH對pSectag2A質粒進行雙向測序，測序結果與NCBI中GenBank上的序列（p35 NM-000882，EBI3 NM-005725）完全一致。

3 討論

1997年，EBI3-p35由Devergne首次發現[1]，在2007年正式被命名為IL-35，后者是IL-12家族的一員，屬于I型細胞因子超家族成員，由α鏈p35和β鏈EBI3組成[4-5]。IL-35主要由Treg、調節性B細胞（Breg）細胞分泌[3]。在Treg表面，IL-35的信號通路由信號傳導及轉錄激活因（STAT）STAT1-STAT4，STAT4-STAT4，STAT1-STAT1介導[6];而在Breg表面，則由STAT1-STAT3介導[7]。

研究發現，IL-35是具有重要免疫調節功能的細胞因子[8]，通過增強Treg細胞的功能，抑制Th17細胞的增殖分化，發揮免疫抑制功能，抑制炎癥反應、防止過度的自身免疫反應的發生[9]。由此可見，IL-35在諸多疾病中，均具有不容小覷的作用。本實驗成功構建了pSectag2A-IL-35真核表達載體，為體內外進一步研究IL-35的功能和作用機制奠定了基礎。

參考文獻

[1] Devergne O，Birkenbach M，Kieff E.Epstein-Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（22）：12041-12046.

[2]石銀月，武桂萍，顏學兵.IL-12細胞因子家族的新成員—IL-35[J/OL].中華實驗和臨床感染病雜志：電子版，2012，2（6）：159-161.

[3] Collison L W，Workman C J，Kuo T T，et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J].Nature，2007，450（7169）：566-569.

[4]王志會.IL-35在免疫相關疾病中的研究進展[J].華中科技大學學報：醫學版，2015，2（44）：239-242.

[5]黃崇標，田野，崔焱，等.白細胞介素35的在腫瘤發展中的作用[J].中國肺癌雜志，2016，19（4）：230-235.

[6]陳爽，鞠曉紅，鄭文彧，等.IL-35與人類疾病關系的研究進展[J].免疫學雜志，2014，7（30）：645-649.

[7]蔣瑜，張松照.細胞因子IL-35研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2017，12（38）：1639-1641.

[8]姚國泰，陳勵.IL-35與人類自身免疫性疾病的關系[J].細胞與分子免疫學雜志，2016，32（7）：993-999.

[9]韓麗，李培，武伏旭.IL-35在腫瘤中的研究進展[J].免疫學雜志，2018，10（34）：906-911.

（收稿日期：2019-01-08） （本文編輯：何玉勤）