補中益氣湯對急性腦缺血大鼠行為學及腦損傷的影響?

王 丹，毛 媛，刑曉娟

(慶陽市人民醫院，甘肅 慶陽 745000)

作者簡介：王 丹(1987-)，女,甘肅慶陽人，主治醫師，醫學碩士，從事神經內科的臨床與研究。

急性腦缺血是常見的腦血管急癥，主要由于頸動脈粥樣硬化和斑塊形成阻塞血管腔所致。急性腦缺血可導致局部組織缺血缺氧性損傷，引發神經功能缺損和認知障礙。我國腦梗塞的發病率高，且超過50%的患者可出現缺血缺氧性認知功能障礙[1]，因此對急性腦缺血后行為和認知功能采取有效措施進行改善至關重要。常規西醫康復治療對此類患者認知功能、神經功能和日常生活能力均有改善作用，但是仍有提升空間[2]。近年來，中醫藥在改善急性腦缺血后認知功能障礙患者認知功能方面的作用逐漸得到認可。補中益氣湯可補中益氣、養陰生津[3]，在腦梗塞恢復期效果確切[4]，但是關于其對急性腦缺血的作用及機制仍需探討。

1 材料與方法

1.1 動物

50只SPF級SD成年雄性大鼠，體質量180～220 g，購自河南省實驗動物中心(許可證號SCXK(豫)2017-015)。

1.2 藥物

補中益氣湯方組成：黃芪15 g，人參15 g，白術10 g，炙甘草15 g，當歸10 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡12 g，生姜9片，大棗6枚，中藥材均購自天津藥材公司，采用水提醇沉淀法提取藥液，每1 ml藥液相當于1 g生藥。

1.3 實驗器材

Morris水迷宮及其配套圖像采集分析系統(寶生物(大連)科技有限公司)，SM2010R徠卡切片機(徠卡顯微系統貿易公司)，電泳儀、CheniDoc XRS化學發光成像分析系統(美國Bio-Rad公司)； CX41-12C02型光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實驗試劑

黑色染料(上海滬江鈦白化工制品有限公司，批號20170506 A)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo公司，批號20170903)；B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Caspase-3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Bax)兔抗鼠單克隆抗體(一抗)、Bcl-2、Caspase-3、Bax牛抗兔單克隆抗體(二抗)(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號E2506、E2413、E2686、E2907、E2915、E2928)。

1.5 分組、造模及干預

將大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型對照組及低、中、高劑量組各10只。建模方法：10%的水合氯醛腹腔麻醉，劑量為350 mg/kg，仰位固定并做頸正中切口，對右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈鈍性分離迷走神經。由頸總動脈分叉處向頭端游離，結扎右側頸總動脈近心端、頸外動脈及其分支動脈，游離主干。分離右側頸內動脈，沿其向下分離翼腭動脈，結扎根部，僅保留頸內動脈入顴骨主干。在頸外動脈近端備線，暫時夾閉其遠端，由頸總動脈分叉處做切口并插入尼龍線(4～0)，推進并通過大腦中動脈起始處，阻斷大腦中動脈部分血流并縫合皮膚。對側操作方法同上。注意將大鼠體溫維持在37.0～37.5 ℃。模型對照組和3劑量組均按照上述方法造模，假手術組除不插線外，其余操作均同上。術后2 h 低、中、高劑量組分別給予補中益氣湯灌胃，參照文獻[5]中大鼠臨床等效劑量計算方法得出用藥劑量，低劑量組0.5 g/kg，中劑量組1.0 g/kg，高劑量組1.5 g/kg，假手術組和模型對照組均給予2 ml生理鹽水灌胃，每天1次，持續2周。

1.6 檢測指標

1.6.1 行為學評價[6]BBB運動功能：持續干預2周后采用BBB運動功能評分評價，共分各關節活動能力(0～7分)、后肢步態及協調能力(0～5分)、運動過程中爪的精細動作(0～9分)3部分共21分，評分越高說明運動功能越理想。

Rivlin-Tator斜板試驗：持續干預2周后采用Rivlin-Tator斜板試驗評價，將大鼠放置在紋理厚度為1 mm的橡皮斜板上，使其身體長軸與斜板縱軸垂直，每次抬高斜板5°，以大鼠能停留5 s的最大角度即為功能值。

Morris水迷宮實驗：持續干預2周后采用Morris水迷宮實驗進行檢測制作水迷宮，宮體直徑150 cm，高60 cm，將水池等分為4個象限，并在宮壁標明4個對應入水點；安全島位于第一象限，平臺直徑約為8 cm，大約高出水平面1 cm，內盛有溫水，平臺上放置少量飼料，水中摻入適量黑色染料。在水迷宮上安裝攝像頭記錄大鼠運動軌跡，共包括定位航行訓練和空間探索試驗。定位航行訓練：第1～5天進行定位航行訓練，每天訓練4次，間隔時間為2 h，隨機選擇入水點，將大鼠面向池壁輕放入水中。記錄小鼠60 s內找到并登上安全島的時間，為逃避潛伏期，若大鼠未能找到安全島，則需要實驗者對其進行引導使其停留30 s，將逃避潛伏期記錄為60 s，將大鼠取出并擦干后放入飼養籠中；空間探索試驗：第6天將安全島撤除，隨機選擇入水點將大鼠放入水中，記錄其60 s內的運動軌跡，統計目標象限內停留時間占比和目標象限內游泳距離占比。

1.6.2 腦指數測定 持續干預2周且完成上次檢測后采用電子天平對大鼠的體質量進行稱量，隨即處死后立即取完整腦組織，稱重后將其放置在冰盤上，腦指數=腦濕質量/體質量×100.00%。

1.6.3 海馬區組織病理學觀察變化 沿著端腦顳葉的內側深部切取海馬區腦組織塊，10%福爾馬林浸泡48 h，脫水、透明和石蠟包埋后進行HE染色，中性樹膠封片在光學顯微鏡下觀察。

1.6.4 海馬區組織凋亡相關蛋白表達檢測 取海馬區組織，采用蛋白免疫印跡法(WB)對Caspase-3、Bcl-2、Bax進行檢測。按蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，并進行蛋白定量檢測。每孔上樣量為20 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，電轉儀電轉120 min轉膜。脫脂奶粉搖床封閉2 h，加入一抗(1∶1000)，4 ℃搖床孵育過夜，加入二抗(1∶10000)，常溫孵育2 h，暗室中曝光、顯影及定影。應用凝膠成像軟件掃描拍照，使用BandScan灰度值分析軟件分析，以Caspase-3、Bcl-2、Bax灰度值與內參β-actin灰度值比值為蛋白表達量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 補中益氣湯對急性腦缺血大鼠行為學和腦指數的作用

表1顯示，假手術組干預期間無死亡，模型對照組與低、中、高劑量組干預期間分別有3只、2只、3只、3只大鼠死亡，因而假手術組、模型對照組、低、中、高劑量組樣本量分別為10、7、8、7、7。與假手術組比較，模型對照組BBB評分、Rivlin-Tator斜板試驗結果均顯著降低(P<0.05)，3劑量組治療后均有顯著改善，其中高劑量組效果最為顯著(P<0.05)。與假手術組比較，模型對照組逃避潛伏期時間延長，而目標象限內停留時間占比、目標象限內游泳距離占比降低(P<0.05)，腦指數顯著增加(P<0.05)。經過藥物治療均有顯著改善，其中高劑量組改善效果最為顯著(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學和腦指數比較

注：與假手術組比較：aP<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05；與低劑量組比較：cP<0.05；與中劑量組比較：dP<0.05

2.2 各組大鼠治療前后海馬腦區的病理染色結果

圖1顯示，假手術組可見神經元排列緊密、整齊，胞體飽滿，結構清晰，分布均勻，數量無減少，無異常形態學改變，椎體細胞層排列緊致、規則，細胞輪廓清晰(圖1 A)；模型組可見神經元嚴重排列稀松，神經組織結構不完整，有嚴重胞核溶解、細胞破裂現象，細胞周圍高度水腫(圖1B)；高劑量組可見神經元排列整齊，結構清晰，分布相對均勻，數量少有減少，椎體細胞層排列相對規則，細胞輪廓清(圖1C)，與假手術組相近；中劑量組可見神經元有所改變，分布不均，數量減少，有部分胞核溶解、細胞破裂現象，椎體細胞層排列不規則，輪廓不清(圖1D)；低劑量組可見神經元排列稀松，神經阻滯結構不完整，胞核溶解、細胞破裂明顯，效果最差(圖1E)。

圖1 各組大鼠海馬區病理染色結果比較(HE染色 ×200)

2.3 補中益氣湯對急性腦缺血大鼠海馬區腦組織凋亡相關蛋白相對表達量的作用

圖2 各組Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達檢測結果

圖2表2顯示，與假手術組比較，模型對照組Caspase-3、Bax蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。經過治療后3劑量組Caspase-3、Bax蛋白相對表達量均有所降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量均有所升高(P<0.05)，其中高劑量組效果最為顯著(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬區組織凋亡相關蛋白相對表達量比較

注：與假手術組比較：aP<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05；與低劑量組比較：cP<0.05；與中劑量組比較：dP<0.05

3 討論

急性腦缺血發生后，由于血液和氧氣供應不足，顱內神經可出現過氧化應激損傷，過多的氧自由基難以及時被清除，且可產生大量促炎癥因子，各種病理學變化相互作用，共同誘發神經損傷[7]，導致神經功能障礙。而損傷的神經支配肢體功能將會出現明顯的障礙，因此保護認知功能有助于改善腦缺血導致的認知與行為障礙。但目前臨床仍缺乏有效的急性腦缺血后認知功能障礙患者行為學和認知功能的改善措施。

本次研究中發現，高劑量組行為學顯著改善，且明顯優于中劑量組和低劑量組，可知補中益氣湯能夠有效改善缺血缺氧性認知功能障礙大鼠的行為學，且高劑量組的效果最佳。此外，HE染色觀察結果顯示，正常組織和細胞結構、狀態均正常，而高劑量組與正常對照組最為接近，提示補中益氣湯對急性腦缺血大鼠認知功能的保護作用顯著，且呈劑量依賴性。中醫認為[8]，急性腦缺血屬于中醫學“卒中”范疇，根本病因在于氣陰兩虛、血瘀氣滯、肝火上亢、風痰阻絡等。補中益氣湯圍繞虛瘀下藥，方中黃芪為君藥，補中益氣、固表升陽，臣以人參、炙甘草、白術健脾益氣；當歸養血和營，陳皮理氣和胃，可使諸藥補而不滯；升麻、柴胡升陽舉陷，以升提下陷之中氣；生姜可增強食欲、活血驅寒；大棗可補血益氣，共為使藥，諸藥合用共達補中益氣、養陰生津、養血和營之功效[9]。補中益氣湯重用黃芪，以補中益氣、升陽固表，且以升麻、柴胡協黃芪、人參升陽舉陷、補氣養血，使甘溫之氣充填內外，元氣內充，故而該方劑可使氣陷者升之，氣虛者補之，清陽得升，元氣得充，病恙得除，諸癥自消。本研究中行為學和HE染色均發現，3劑量組結果顯著改善，可知補中益氣湯中諸多成分能夠協同作用，對急性腦缺血大鼠發揮改善行為學和腦保護的作用，推測在臨床中具有可行性，但仍需臨床試驗證實。現代藥理研究證實[10-11]，黃芪、人參等補氣中藥能夠增強機體的抗缺氧能力，改善缺氧狀態，減輕氧化應激損傷和神經功能缺損程度，改善行為學。

本研究還顯示，與假手術組比較，模型對照組海馬區組織Caspase-3、Bax蛋白相對表達量顯著升高，而Bcl-2蛋白表達量顯著降低，可知在急性腦缺血大鼠中海馬區組織Caspase-3、Bax蛋白表達異常升高，而Bcl-2蛋白表達異常降低。經過治療后3劑量組Caspase-3、Bax蛋白相對表達量均下降，Bcl-2蛋白表達量均升高，其中高劑量組效果最佳，可知補中益氣湯在急性腦缺血大鼠中應用能夠下調Caspase-3、Bax蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達。大鼠海馬區組織主要發揮記憶和空間定位作用，在急性腦缺血所致的腦損傷發生過程中出現海馬區損傷，損傷其神經功能進而導致行為障礙。故本次研究選取海馬區組織作為對象檢測相關蛋白，探討補中益氣湯的作用機制。Bcl-2可通過調控細胞自身基因，啟動死亡效應級聯反應，在神經元細胞凋亡和認知功能損傷中發揮作用[12-13]；而Caspase-3是與Bcl-2相關的一類蛋白，且與Bcl-2高度同源，當Caspase-3同源二聚體含量升高，可加快神經元細胞的凋亡，加重認知功能損傷；Bax具有重要的調控神經元細胞凋亡的作用，正常情況下表達量低，一旦被激活，可通過細胞表面死亡受體途徑或線粒體途徑誘發細胞凋亡[14-15]。本研究中發現，采用補中益氣湯能夠調控凋亡相關蛋白，發揮對神經元的保護作用。推測補中益氣湯能夠通過下調Caspase-3、Bax蛋白表達、上調Bcl-2蛋白表達，抑制神經元細胞凋亡，改善急性腦缺血大鼠的行為學，發揮腦保護作用。

綜上，補中益氣湯能改善急性腦缺血大鼠的行為學，發揮腦保護作用，推測與下調Caspase-3、Bax蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達有關，但在急性腦缺血患者中的作用機制仍需深入探討。