不同活血化瘀方劑對心衰大鼠心功能及MMP-2的影響?

張 洋，王志娟，張 艷，劉曉宇△，孔繁達

(1. 大連醫科大學附屬第二醫院中醫科，大連 116000； 2. 航天中心醫院，北京 100049；3. 遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032； 4. 遼寧中醫藥大學，沈陽 110032)

心力衰竭(簡稱心衰) 是各種原因引起的心臟結構和功能變化，即以心室重構為主要改變的心臟泵血功能障礙，臨床上以肺循環瘀血和(或)體循環瘀血及組織血液灌注不足為主要表現[1]。基質金屬蛋白酶2(MMP-2)作為基質金屬蛋白酶家族的重要成員，與心衰的發生發展關系密切；當心衰發生時，MMP-2的表達和活性逐漸增強，MMP-2的含量水平與心衰進程成正相關[2]。本實驗研究選用ACEI類藥物中的賴諾普利作為陽性對照藥物，ACEI為治療心衰的基石類藥物，研究顯示ACEI可抑制心衰時MMP-2的表達，并通過抑制心室重構及改善心功能達到防治心衰的作用[3-4]。活血化瘀類中藥作為臨床治療心衰的有效方藥，可顯著緩解心衰癥狀，改善心臟功能，提高患者生活質量[5-6]。桃紅四物湯為活血化瘀類基礎方劑，血府逐瘀湯、補陽還五湯等諸多活血化瘀方劑均由此方化裁而來。目前鮮見活血化瘀方劑對心衰后心功能及MMP-2影響的相關研究報道。本研究旨在觀察不同活血化瘀方劑對心衰大鼠心功能及心肌中MMP-2的表達影響，從中篩選出療效突出的方劑，并探討其作用機制及靶點，為中醫藥防治心衰提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所需動物由遼寧長生生物技術有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。選用12周齡、普通級、健康、雄性SD大鼠100只，體質量220～260 g。

1.2 造模與分組

圖 1、2顯示，大鼠經7 d適應性喂養后，按每100 g給予10%水合氯醛0.4 mL行腹腔注射麻醉。備皮后于左側第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋間組織剝離心包膜暴露心臟，于左冠狀動脈前降支起點處結扎冠狀動脈前降支，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術后連續注射青霉素鈉3 d以預防感染。常規喂養1周后將飼料減半，同時每日游泳至其力竭，每日1次，共4周；行心臟超聲檢測大鼠左室射血分數(LVEF)，計算心臟指數(CI)；以LVEF≤50%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作為心衰成功造模的標準[7-8]。將造模成功的大鼠按隨機數字表法分為模型組、賴諾普利組、桃紅四物湯組、血府逐瘀湯組、補陽還五湯組，未行冠脈結扎的大鼠為空白對照組，每組各10只大鼠。

圖1 空白對照組與造模后大鼠心臟超聲比較

1.3 藥物與給藥劑量

桃紅四物湯組由桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍、熟地等中藥組成，補陽還五湯組由黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等組成，血府逐瘀湯組由桃仁、紅花、川芎、赤芍、當歸、生地、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草等組成，中藥方劑制劑由天江藥業有限公司提供，處方中的全部藥材均符合《中國藥典》2010年版有關規定[9]。賴諾普利片(10 mg/片)產自信誼萬象藥業(國藥準字H10960265)。空白對照組與模型組灌胃蒸餾水3 mL/次，每日1次。各給藥組大鼠按人鼠劑量換算，給藥劑量(g/kg)=給出的人的劑量(g)×系數(0.018)/所求動物體質量(kg)[10]。各中藥組給藥為9.2 g生藥/kg，賴諾普利組給藥為1.5 mg生藥/kg，給藥組藥物均溶于3 mL蒸餾水中，每日1次灌胃，上述各組均灌胃6周。

1.4 檢測方法

給藥4周后行心臟超聲檢測各組大鼠的心功能，包括：左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)、射血分數(LVEF)、每搏輸出量(SV),遂處死全部大鼠，每只大鼠心臟按標準處理，取100 mg心肌組織標本，于液氮中冷凍后再保存待測,分別用于免疫組化法及實時定量熒光PCR檢測心肌組織中MMP-2的表達。

1.4.1 心肌免疫組化學檢測 3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，磷酸緩沖液(PBS) 沖洗2 min×3次；分別滴加一抗MMP-2受體抗體(稀釋比例1∶300)，37 ℃孵育 1 h，PBS 沖洗2 min×3次；滴加兔抗山羊IgG抗體，室溫孵育30 min，PBS 溶液沖洗2 min×3次；DBA顯色，顯微鏡下觀察并控制反應時間，待組織著色而背底顏色較淡時馬上吸去顯色液；蒸餾水充分沖洗，蘇木精輕度復染，乙醇脫水、透明、中性樹膠封片。以心肌胞質染成棕褐色為陽性細胞標志，采用Imagepro-Plus 6.0圖像分析軟件測定心肌組織切片陽性表達區的積分光密度值(IOD)，取平均值作為IOD。

1.4.2 心肌實時定量PCR檢測 采用TRIZOL從心肌組織中提取總RNA(100 mg/mL)，提取方法嚴格按照說明書操作。在逆轉錄反應體系中加入RNA 2μg，10×RT Mix2μL，NTP混合液2 μL，OligodT152 μL，QuantReverse Transcriptase 1 μL，加入RNase-free水。逆轉錄反應體系在37 ℃下反應60 min，在70 ℃下15 min使產物變性。合成的cDNA于-20 ℃下保存。MMP-2上游引物 5’-GAAGCATCAAATCGGACTG-3’，下游引物5’-GGCGGGAGAAAGTAGCA-3’，產物長度251 bp。PCR反應條件均為:95 ℃預變性5 min 94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s,重復35個循環后,72 ℃ 5min。梯度稀釋的正常組cDNA，以各引物完成定量PCR反應，再將各組cDNA進行定量PCR檢測。實時定量PCR數據統計采用相對定量法。以2-ΔΔCt(Livak)法比較未經處理樣品和已處理樣品目標轉錄之間的表達差異。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠心功能檢測結果

表1顯示，與空白對照組比較，模型組ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降(P<0.05)；各給藥組ESV、EDV較模型組明顯下降,LVEF、SV明顯升高(P<0.05)。給藥組組間比較，補陽還五湯組較其他3組ESV、EDV明顯下降，LVEF、SV明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達結果

表1圖2顯示，與空白對照組比較，模型組心肌組織MMP-2的IOD值及mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；各給藥組MMP-2水平較模型組差異有統計學意義(P<0.05)。給藥組組間比較，補陽還五湯組MMP-2的IOD值及mRNA水平較其他3組下降更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，空白對照組及各給藥組MMP-2的陽性表達明顯減少(P<0.05)；與補陽還五湯組比較，其他3給藥組MMP-2的陽性表達明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠心功能、MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達結果

注：與空白對照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與補陽還五湯組比較：#P<0.05

注：A.空白對照組；B.模型組；C.賴諾普利組；D.桃紅四物湯組；E.血府逐瘀湯組；F.補陽還五湯組圖2 (A～F) 各組大鼠心肌組織MMP-2免疫組化染色 (40×)

3 討論

“心衰”作為病名首見于西晉·王叔和《脈經·脾胃部第三》：“心衰則伏，肝微則沉，故令脈伏而沉”[11]。現代醫學的心衰與中醫文獻記載的心衰尚存在一定差異，屬于中醫學“胸痹、水腫、喘證、心悸”等范疇。中醫古代文獻對于心衰的命名只是抓住了心衰的一些臨床癥狀進行闡述，而不是將心衰作為一個獨立的疾病，不利于反映心衰作為一個疾病發生發展的全過程。目前多主張以“心衰病”命名，更有利于體現其疾病特征[12]。臨床中心衰以“血瘀”證候為主要表現，“不通則痛”決定了心衰的病因病機主要為“血瘀”所致，故活血化瘀視為心衰的基礎治則。本研究選用桃紅四物湯、血府逐瘀湯及補陽還五湯作為研究藥物，三方均為活血化瘀類代表方劑。桃紅四物湯以祛瘀為核心，輔以養血行氣，使瘀血祛、新血生、氣機暢，化瘀生新為該方顯著特征。血府逐瘀湯與補陽還五湯皆由桃紅四物湯化裁而來。其中血府逐瘀湯主治諸癥皆為瘀血內阻胸中、氣機郁滯所致，即王清任所稱“胸中血府血瘀”之證。補陽還五湯方中重用黃芪以補氣，使得氣帥血行；另配地龍引領活血化瘀諸藥貫通經脈以達末節之地，故此方更偏于益氣活血、化瘀通絡。

心室重構是心衰發生發展的核心機制。心室重構是心室由于心肌損傷或負荷(壓力或容量)加重等因素，導致心肌結構發生改變和心臟功能下降等一系列復雜的病生理過程。心室重構主要表現為心室肥厚、心室腔擴大等心肌結構的改變[13]。本研究通過心臟超聲檢測大鼠心功能發現，模型組大鼠ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降，說明心衰大鼠出現心室腔擴大、左室增厚、心臟收縮功能下降等心肌結構和功能改變，提示大鼠存在心室重構。經藥物治療后大鼠心肌結構及功能均有明顯改善，表現為ESV、EDV明顯下降及LVEF、SV明顯升高，說明中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補陽還五湯和西藥賴諾普利在治療心衰過程中均起到了抗心室重構和改善心功能的作用，且補陽還五湯效果優于桃紅四物湯、血府逐瘀湯及賴諾普利。

研究表明，心衰時心肌組織中MMP-2的表達顯著增高，高表達的MMP-2可降解正常膠原組織，使心肌膠原網絡發生重構，進而導致心室重構惡化，從而加快心衰的進程[14]。而通過下調心衰時心肌MMP-2的表達，可有效改善心功能，抑制心室重構，進而達到治療心衰的作用[15]。本研究發現，中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補陽還五湯和西藥賴諾普利均可下調心衰大鼠心肌中MMP-2的表達，其中補陽還五湯在下調心肌MMP-2的表達上優于桃紅四物湯與血府逐瘀湯及賴諾普利。本研究表明，上述中藥活血化瘀方劑可通過改善心衰時受損的心臟功能及抑制心肌MMP-2的表達起到治療心衰的作用，其作用機制可能是通過抑制心肌MMP-2活性，從而調節心肌膠原的分布及代謝，修復受損心肌組織，增強心肌的抗牽拉性和彈性，從而提高心肌整體收縮力，改善心功能，抑制心室重構，進而達到治療心衰的作用。本研究佐證了“活血化瘀”治則在治療心衰中的重要意義，為“通則不痛”的中醫理論提供了科學客觀的實驗依據。