桃紅四物湯對UV輻射致人真皮微血管內皮損傷后TGF-β、Smad2/3表達影響的實驗研究?

張小卿，馬賢德，吳 怡，王建軍，吳景東△

(1. 遼寧中醫藥大學，遼寧省針灸養生康復重點實驗室，沈陽 110847； 2. 遼寧中醫藥大學附屬二院， 沈陽 1100342； 3. 西安海棠職業學院，西安 710038)

日光中的長波紫外線(UVA)輻射可深入皮膚真皮以下的組織，破壞皮膚膠原蛋白，彈性纖維組織等微細結構產生皺紋，令皮膚松弛衰老，這在醫學上稱之為皮膚光老化[1]。中醫學認為皮膚光老化主要由光毒侵襲所致，且其傷害無法逆轉[2]。光毒侵襲日久，導致體內正氣虛損，日久氣血漸衰，運行緩滯，血脈瘀阻，以致血瘀。桃紅四物湯在臨床治療由血瘀引起的多種病證都有顯著效果，在皮膚科常用以治療黃褐斑、過敏性紫癜等疾病。基于前期對UV輻射致人真皮微血管內皮細胞(HDMEC)損害的研究發現，轉化生長因子(Transforming growth factor， TGF-β)活性表達的增加，具有促進Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白含量的作用，細胞中釋放的TGF-β受體激活Smad蛋白后，形成的TGF-β/Smads信號傳導通路可以通過調控其下游的基因表達來控制膠原合成，因此本實驗觀察了桃紅四物湯對UVA輻射致HDMEC細胞損傷后TGF-β、Smad2/3的含量表達，進而探討其對皮膚光老化的防治作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級8周齡SD雄性大鼠20只，體質量(200±20) g，購自遼寧本溪長生生物技術有限公司(許可證號SCXK(遼)2010-0001)。

1.2 桃紅四物湯方藥組成

熟地15 g，當歸15 g， 白芍10 g， 川芎8 g， 桃仁9 g，紅花6 g。

1.3 實驗細胞

人真皮中微血管內皮細胞(HDMEC)購自通派(上海)科技有限公司。

1.4 實驗試劑

Anti-TGF-β: ab92486，兔多克隆抗TGF -β抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-Smad2: ab33875，兔單克隆抗Smad2 抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-Smad3: ab40854，兔單克隆抗Smad3抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司；Anti-β-actin：ab8226，小鼠單克隆抗β-Actin抗體，適用于人、小鼠、大鼠等來源樣本，ABCAM公司。TUNEL試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGA7071。

1.5 實驗儀器

UV輻照計(UV-340)，上海Sigma高科技有限公司；全自動酶標儀(anthos 2010型)，奧地利anthos公司；倒置熒光生物顯微鏡，德國萊卡公司；多孔離心機(c412)，法國Jouan公司；細胞培養瓶(25 cm2)，美國康寧公司；培養板(6孔、96孔)，美國康寧公司；凝膠成像分析系統(Chemi Imager 5500型)，美國Alphainnotech Chemi Imager 公司；垂直版電泳裝置(Mini-Protein Ⅲ型)，美國BIORAD公司。

2 方法

2.1 含藥血清的提取

將25只SD大鼠隨機分成5組，空白血清組給予生理鹽水2 ml/只，陽性對照組給予維生素E0.09 mg/只，其余3組分別給予高劑量桃紅四物湯、中劑量桃紅四物湯、低劑量桃紅四物湯。桃紅四物湯給藥量根據《等效劑量系數折算法》計算200 g大鼠每天為1.23 g，低、中、高劑量含藥血清組采用3、6、9倍等效劑量作為實驗用量，將藥物濃縮至2 ml，灌胃7 d后提取大鼠血清。

2.2 紫外線照射

取對數生長期的HDMEC細胞，照射前棄去舊培養液，0.25%胰酶消化后，加入新鮮培養液制成細胞懸液接種于96孔板，于37 ℃ 5%CO2培養箱培養24 h后棄去舊的培養液，PBS清洗2次，反復洗至PBS無色加入200 μL PBS，放在紫外線下照射。照射前用UV輻照計測試UVA紫外燈強度，照射距離固定，UV劑量=UV輻照強度×時間，對照孔給予錫箔紙覆蓋，照射后吸去孔內PBS，加入新鮮培養液放回培養箱內繼續培養。

2.3 MTT 法檢測不同劑量UVA對HDMCE細胞增殖活性的影響

不同劑量UVA(2、5、8、10 J/cm2)照射HDMCE細胞后培養24 h，加入20 μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT， 5 g/L)，37 ℃培養箱繼續孵育4 h后終止培養，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)低速振蕩致均勻混合，酶標儀選擇OD 490 nm處測量各孔A值。

2.4 細胞分組及干預

將HDMEC細胞株分為空白對照組、模型對照組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯中劑量組、桃紅四物湯低劑量組和陽性對照組6組。除空白對照組外，其余各組細胞株均給予5 J/cm2的UVA照射，之后模型對照組加入空白血清培養液，其他各組加入相應含藥血清培養液，培養24 h收集細胞及50 ml培養上清液，用于檢測上清液中TGF-β含量。瓶底部的細胞用PBS緩沖液洗滌3次，末次棄掉PBS后，加入1 ml WB及IP細胞裂解液，輕搖培養瓶使裂解液鋪滿瓶底，冰面上裂解15 min，然后以移液器吹打裂解液，使細胞全部裂解，冰面上靜置5 min后，12000 g離心力，4 ℃離心15 min，上清液即為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，采用凝膠成像分析系統自帶軟件測定目的蛋白和內參蛋白條帶的灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值，作為該蛋白的相對表達水平進行統計分析。

2.5 采用Tunel法對各組細胞凋亡進行檢測

圖1 不同強度UVA照射細胞活性OD值折線圖

制備細胞爬片，并以2%多聚甲醛溶液固定24 h，然后在流水下充分沖洗，吸干爬片周邊水分后滴加蛋白酶K，37 ℃孵育30 min透膜，然后PBS洗滌3次。滴加TDT酶反應液50 μl/片，37 ℃避光孵育60 min。取出爬片后PBS漂洗3次，滴加Streptavidin-Fluorescein 標記液，濕盒中37 ℃孵育30 min，取出后洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。每張細胞爬片選取5個染色良好視野，計數每個視野中凋亡的細胞數，以5個視野的平均凋亡數作為該例樣本的細胞凋亡水平并進行統計分析。

3 結果

3.1 UVA照射后HDMEC增殖活性變化顯示

隨著UVA照射時間的加長即照射劑量的不斷加大，各照射組細胞活性明顯減弱(P<0.05)，UVA照射劑量為5 J/cm2時，OD值切線與X軸的夾角呈最大，說明在此照射劑量時HDMEC活性被明顯抑制。因此本研究選擇UVA劑量為5 J/cm2，作為HDMEC損傷模型的UVA照射劑量。

3.2 細胞凋亡情況

表1圖2顯示，與空白對照組比較，模型對照組細胞凋亡數顯著上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，桃紅四物湯含藥血清干預的各組細胞凋亡數均顯著下調，差異有統計學意義(P<0.01)，且高劑量含藥血清組干預效果最為顯著。

注：圖中淺色箭頭所示為發生凋亡的細胞圖2 各組細胞凋亡情況比較

表1 各組細胞凋亡率及細胞培養上清液中TGF-β含量比較

注：與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組對照比較：##P<0.01；與桃紅四物湯高劑量組比較：▲▲P<0.01

3.3 細胞培養上清液中TGF-β含量

表1顯示，與空白對照組比較，其余5組細胞TGF-β含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，高中低劑量桃紅四物湯組及陽性對照組細胞培養上清液中TGF-β含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，尤以高劑量和陽性對照組上升最為明顯。

3.4 各組細胞中TGF-β、Smad2/3表達結果

表2圖3顯示，UVA輻射后各組TGF-β、Smad2/3表達降低(P<0.01)；與模型對照組比較，桃紅四物湯高、中劑量組及陽性對照組細胞中TGF-β表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與高劑量組比較，低劑量組TGF-β表達上升不明顯，中、低劑量組Smad2/3表達上升不明顯，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組細胞中TGF-β、Smad2/3蛋白表達水平比較

注：與空白對照組比較：**P<0.01；與模型對照組比較：##P<0.01；與桃紅四物湯高劑量組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖3 各組細胞中TGF-β、Smad2/3蛋白條帶比較

4 討論

日光中的紫外線過量照射皮膚，侵襲肌膚腠理，屬于外邪致病范疇，中醫稱為“光毒”，感受光毒侵襲是引起皮膚光老化的重要病因之一。“光”性炎熱屬陽，為熱毒之一。《洞天奧旨》記載：“日曬瘡，乃夏天曝烈之日曝而成者也，必先疼而后破，乃外熱所傷，非內熱所損也。[3]”當光毒熱邪侵入人體后，火熱蘊結灼傷津液，耗氣傷血，日久則氣血虧虛，血液運行遲滯。所以，氣血運行不暢致使氣血阻滯，血脈瘀阻，易出現色素沉著、斑塊瘀積、皮膚日久失去氣血濡養，則加快皮膚衰老的進程[4]。由此可見，血瘀內結是皮膚光老化的主要發生機制，我們可以從活血化瘀角度防治皮膚光老化的發生與發展。

UV輻射引起皮膚光老化的損傷機制包括氧化應激、DNA損傷、炎癥反應、免疫抑制、晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)、分解細胞間基質、減少細胞間基質合成、破壞皮膚組織間結構、提高細胞突變頻率、延緩細胞周期、誘發細胞凋亡等[5-7]方面。真皮微血管內皮細胞是真皮的主要細胞，組織定位決定了真皮微血管內皮細胞在皮膚各種生理及生化反應中發揮著關鍵作用[7]，能夠活化參與多種生理過程，通過增殖、休眠、凋亡和老化這4個基本細胞狀態建立皮膚微血管維持和重塑之間的動態平衡。長期照射可以引起真皮微血管內皮細胞結構和功能的改變，血管通透性明顯增高，導致氧化損傷的發生及炎癥因子的聚集，從而影響真皮的結構和功能，導致皮膚損傷及光老化的發生。桃紅四物湯中含有的多種有效成分，李雙雙等[8]測定桃紅四物湯中含有苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、梓醇、地黃苷A、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶酸、綠原酸、沒食子酸9種水溶性活性成分。上述成分可以清除血液內的自由基，提高抗氧化酶活性，抑制UV誘導的膠原蛋白降解，改善皮膚微循環，從而減緩皮膚的衰老，增強皮膚的抗衰老能力。

通過前期對UV輻射致人真皮微血管內皮細胞損害的研究發現，TGF-β活性表達的增加具有促進Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白含量的作用，與皮膚光老化發病機制密切相關，具有調節炎癥、防止細胞外基質的降解、促進血管生成和膠原合成的作用[9]。Smad蛋白是介導TGF-β信號傳導過程中的關鍵，TGF-β受體被激活后磷酸化產生Smads蛋白，與TGF-β超家族形成TGF-β/Smads信號傳導通路共同發揮調控細胞因子的作用與生理功能[10]。紫外線照射可通過影響TGF-β/Smads信號傳導通路，使體內膠原蛋白水平表達降低[11]，進而出現皮膚衰老。Gambichler[12]等學者發現，經過UV輻射24 h后的皮膚中TGF-β與Smads蛋白含量表達明顯減少，TGF-β信號傳導通路在Smad2/3的誘導下影響膠原蛋白的合成，加速了衰老。另外，基質金屬蛋白酶(MMPs)在皮膚光老化發生機制中起核心作用。何永靜[15]等通過觀察UVA 照射下TGF-β1對成纖維細胞中MMP-1、MMP-3 的表達影響證實，TGF-β1可以通過抑制細胞中 MMP-1、MMP-3mRNA 的表達降低，促進對Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成，說明TGF-β1對成纖維細胞起到保護作用以及在皮膚光老化形成機制中具有重要作用。

本研究發現，HDMEC經過UV輻射刺激受到損害后，細胞中TGF-β的表達含量降低，直接導致其分泌的Smad蛋白減少，由Smad介導的TGF-β/Smad信號傳導通路信號的調控作用則會隨之減弱，用不同劑量的桃紅四物湯含藥血清干預后，各組細胞中TGF-β、Smad2/3的表達含量都有不同的升高，且劑量越高效果越好，說明桃紅四物湯可以促進受損的HDMEC分泌TGF-β、Smad蛋白含量，增強TGF-β/Smad信號傳導通路的信號強度，使其能夠正常發揮對下游信號分子的調控影響作用，為應用桃紅四物湯治療皮膚光老化的研究提供新的實驗依據。