藏雞禽流感抗體消長規律研究

凌夢娟，王一飛，貢 嘎，董海龍，田發益，吳慶俠*

（西藏農牧學院 臨床獸醫學重點實驗室，西藏 林芝 860000）

藏雞是我國青藏高原的地方雞種，主要分布于我國青藏高原海拔2 200～ 4 100 m的半農半牧區、雅魯藏布江中游流域河谷區和藏東三江中游高山峽谷區。該雞體型輕小，胸腿肌肉發達，活潑好動，覓食能力強，極耐粗放，對高海拔地區的高寒惡劣氣候條件有良好的適應能力，是發展我國高海拔地區養雞業的重要品種資源[1-2]。

世界動物衛生組織(OIE)規定的A類傳染病中，禽類烈性傳染病只有兩種，分別是禽流感和新城疫[3]，禽流感又叫真性雞瘟或者歐洲雞瘟，是一種由A型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽類的一種急性、高度致死性傳染病，以急性敗血性死亡到無癥狀帶毒為特征，主要對雞的泌尿系統、消化系統和呼吸系統產生影響，是現階段嚴重威脅雞健康生長的病毒，也曾引起過人類的感染，需要各級部門對其高度重視[4]。

禽流感給禽類養殖戶帶來的經濟損失很大，防治禽流感的重要措施是疫苗免疫。疫苗接種后抗體產生的水平高低直接影響免疫的效果[5]。禽流感對雞紅細胞具有良好的凝集作用，檢測禽流感抗體的經典實驗室方法是血凝抑制試驗，并被廣泛使用。AIV-HI效價檢測方法對疫苗免疫效果的評價和最佳免疫時機的確定都具有重要意義。ELISA檢測目前已經趨于標準化，也是檢測禽流感的一種常用方法，其特異性和敏感性高、成本低，已被廣泛用于臨床的診斷檢測。為有效控制禽流感在林芝市的發生與流行，確保雞禽流感疫苗免疫效果，本實驗通過血凝抑制試驗和ELLISA雙重試驗，探討了禽流感抗體在藏雞體內的消長規律，為制定西藏林芝地區藏雞禽流感最佳免疫程序提供有效的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 西藏農牧學院臨床獸醫樓養殖的86只藏雞，并對其進行禽流感疫苗免疫接種。

1.1.2 免疫疫苗 雞禽流感、傳染性支氣管炎二聯活疫苗（La-sota株+H120株），批號：201631，生產日期：20170603，有效期18個月；雞禽流感、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯滅活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批號：201705，生產日期：20170616，有效期12個月；重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9-Re1株），批號：201703，生產日期：20170618，有效期：12個月；雞禽流感、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯滅活疫苗（La-sota株+M41株+HZ株），批號：201705，生產日期：20170616，有效期：12個月。以上所有疫苗均由哈藥集團生物疫苗有限公司生產。

1.1.3 免疫程序 禽流感疫苗免疫程序見表1。

1.1.4 血清樣品 2018年7月20日對西藏農牧學院臨床獸醫樓養殖的5日齡藏雞進行首免，2018年8月15號完成三次免疫。免疫全部結束后每隔2周隨機選取20只藏雞，翅下靜脈采血2 ml。共采血14次。將采集好的血液靜置30 min后，4 000 r/min，離心15 min后吸取上層血清移至滅菌的離心管中，-20℃保存備用。

1.1.5 試驗儀器與試劑 雞禽流感病毒（AIV）抗體檢測試劑盒購自深圳市芬德生物技術有限公司，貨號：E320106。恒溫培養箱、離心機、酶標儀、振蕩儀、96孔微量板、微量加樣槍、微型振蕩器、超純水均由西藏農牧學院臨床大樓實驗室提供，雞禽流感標準抗原，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗體數值檢測 嚴格按照禽流感病毒（AIV）ELISA抗體檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）實驗的檢測

表1 藏雞禽流感免疫程序

1.2.2.1 1%紅細胞懸浮液的配制 隨機選取1只成年藏雞，無菌抗凝管，翅下靜脈采血10 ml，1 700 r/min離心8 min，棄上層血清和白細胞層，加入15 ml生理鹽水，再次1 700 r/min離心8 min，棄上清液，以上操作重復3至4次直至上清液透明。操作完畢之后，微量加樣槍吸取5 μl紅細胞加入495 μl生理鹽水中，充分混勻，即制成1%紅細胞懸浮液。放入4℃冰箱保存備用。不超過5天。

1.2.2.2 血凝（HA）試驗 用96孔微量反應板，1～12孔每孔加入25 μlPBS，其中12孔為對照組。吸取25μl病毒懸液加入第1孔混勻，倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄去，然后每孔加入25μl的PBS，最后每孔再加入1%的紅細胞懸液25μl，震蕩混勻，室溫靜置40 min，對照孔紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底，觀察結果。

1.2.2.3 配制4個血凝單位的抗原（4HUA） 能使紅細胞全部凝集（100%凝集，＋＋＋＋）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為一個血凝單位（HUA)。以完全血凝病毒最高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即為配制含4個血凝單位抗原的稀釋倍數。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原稀釋倍數應是1:64（256除以4）。

1.2.2.4 血凝抑制（HI）試驗 在微量反應板上，1～11孔各加入25 μl PBS，第12孔加入50 μl PBS，然后第1孔加入25 μl待檢血清，倍比稀釋至第11孔，棄去25 μl，1～11孔各孔均加入上述配制的4個血凝單位的標準病毒懸液25 μl，室溫靜置30 min，最后每孔加入25 μl的1%雞紅細胞懸液，震蕩混勻，室溫靜置40 min，判定結果。以完全抑制最高稀釋倍數為HI滴度。通過血凝實驗確定禽流感抗原的血凝效價，采用血凝抑制試驗(HI)對血清樣品進行禽流感抗體檢測。

表2 雞禽流感抗體合格率和抗體效價

1.3 結果判定

1.3.1 ELISA實驗判定方法

實驗正常的情況下，陰性對照吸光值≥1.0，陽性對照吸光值≤陰性對照吸光值×50%。

以PI值為判定結果，PI(阻斷值）=（1-樣品值/陰性對照孔均值）×100%，PI≥50%為陽性；PI＜50%為陰性。根據PI值高低可作為抗體水平強、中、弱的估算。

1.3.2 HA結果判斷

＋＋＋＋：紅細胞全部凝集，均勻鋪于孔底，即100%紅細胞凝集；＋＋＋：紅細胞凝集基本同上，但孔底有大圈；＋＋：紅細胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝塊；＋：紅細胞于孔底形成小圓點，四周有少許凝集塊 ；－：紅細胞于孔底呈小圓點，邊緣光滑整齊，即紅細胞完全不凝集。

1.3.3 HI結果判定

以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清抗體滴度。根據GBT18931-2003《高致病性禽流感診斷技術》制定的檢驗規程進行判定，禽流感H1抗體效價≥4log2為免疫合格[6]。

2 結果

2.1 血凝抑制（HI）實驗結果

血凝抑制實驗見表2和圖1。表2表明，在按程序完成三次免疫后第6周抗體合格率（100%）大于標準值70%，一直持續到第24周，第24周降至標準值以下；圖1表明，在按程序完成三次免疫后第2周，抗體水平迅速上升。第10周抗體水平達到高水平并維持至第20周。直到第24周，抗體水平降至臨界值附近，而第26周，抗體效價已下降到1log2，28周抗體水平幾乎接近0，均表明無抗體存在。只有在第4周至第24周，檢測的所有藏雞血清中的抗體數值（PI）平均數值都在50%以上，抗體效價平均值都在4log2以上，并且抽檢合格率都大于70%，符合國家農業部標準。按本防疫程序防疫禽流感后，有效抗體在藏雞體內維持時間為5個半月。

圖1 不同日期藏雞體內禽流感抗體效價值走勢

2.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）結果

ELISA結果見圖2，本實驗的陽性值分別為1.85635和1.7646，陰性值分別為0.6315和0.7271，陰性對照吸光值≥1.0，陽性對照吸光值≦陰性對照吸光值×50%，所以本實驗成立。對每次隨機試驗的20只藏雞數據進行整理取其均值，由圖1可知31日齡藏雞完成三次免疫，經2周后，抗體水平迅速上升。在第10～20周，抗體水平達到高峰，持續保持在一定水平。從20周開始時，抗體水平開始逐漸下降，直到第28周時，抗體水平降至臨界值附近。

圖2 不同日期藏雞體內禽流感抗體PI值走勢圖

3 討論與分析

禽流感是嚴重威脅養禽業發展的傳染病之一，野生水禽也極易感染，人也可感染[7]?；疾‰u具有典型的精神委頓，飲水量、采食量下降，流淚、腫頭，眼睛不圓內有泡沫、冠發紫[8]。病雞的體溫升高, 羽毛暗淡無光, 呈現一種松亂的狀態，患雞的雞冠顏色也變暗, 大量分泌物存在鼻腔內, 并伴有頭部咳嗽、水腫以及結膜發炎癥狀。有些患雞會會有抽搐、痢疾癥狀，產蛋量下降明顯[9]。

從實驗結果來看，ELISA的結果和抗血凝實驗結果的走勢規律是一致的。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）PI數據結果顯示，31日齡藏雞完成三次免疫后的第2周，抗體才開始迅速上升。在第10周至第20周，抗體水平達到高峰，維持平穩時間長。在第28周時，抗體水平已經接近臨界值。此時血凝抑制實驗（HI）的抗體效價已經下降到1log2，小于農業農村部標準4log2，此時已經達不到抵抗禽流感病毒的能力，存在風險。建議進行下一次免疫。血凝抑制實驗（HI）的抗體效價只有在第4周至第24周，抗體效價平均值都在4log2以上，并且抽檢合格率都大于70%，符合標準，且檢測的所有藏雞血清中的抗體數值（PI）平均數值都在50%以上，數據顯示禽流感有效抗體在藏雞體內維持時間為5個半自然月。第24周（2月15日）時，酶聯免疫吸附實驗（ELISA）PI數據為60%，即使大于標準線50%，但此時血凝抑制實驗結果的抗體效價已經接近臨界值附近，應該進行下一次免疫。

禽流感血凝和血凝抑制試驗是目前實驗室中最常用的檢測免疫抗體方法之一，但血凝和血凝抑制試驗方法在操作中常有較多的影響因素，容易造成試驗結果出現偏差[10]。酶聯免疫吸附實驗有高度的活性和靈敏性的優勢，在僅做酶聯免疫吸附實驗（ELISA)檢測禽流感抗體效價消長規律時，當PI值為60%時，需要對藏雞進行下一次免疫，如果等PI值降至50%時，雖然結果為陽性，但此時雞群體內的抗體已經不足以抵御禽流感病毒。所以一定要在大于標準值50%之前進行下一次免疫，以減少經濟損失。

4 結論

本研究彌補國內西藏林芝地區禽流感抗體在藏雞體內的消長規律空白，科學評價雞禽流感疫苗的免疫效果，合理制定雞場禽流感免疫程序。本實驗采用血凝實驗(HA)、血抑制實驗(HI)和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）方法檢測藏雞體體抗體水平。發現按本防疫程序防疫禽流感后，禽流感有效抗體在藏雞體內維持時間為5個半自然月，建議完成三次免疫程序后第24周進行下一次免疫。這為制定西藏林芝地區最佳藏雞禽流感免疫程序提供有效的參考依據。