食線蟲性真菌F088分生孢子在不同滲透壓下萌發率的探究

龔賽賽，魏佳歡，譚海川，黃艷宏，潘 立，蔡葵蒸*

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

現階段世界各地對家畜胃腸道寄生線蟲的防治幾乎完全依賴于化學驅蟲藥，如阿維菌素、苯并咪唑、左旋咪唑等，隨著驅蟲藥的不斷使用，寄生蟲抗藥性不斷增強，驅蟲藥的大量使用給自然環境造成了一定污染，而且會導致畜產品中有一定的化學藥物殘留，從而對人畜的健康產生威脅[1,2]。因此，很多科學家在抗寄生蟲家畜品種的培育、草場管理系統、開發寄生線蟲疫苗以及利用食線蟲性真菌的生物防治等方面投入了大量精力。為了克服寄生蟲抗藥性逐漸增強，通過生物之間存在的拮抗作用防治這些動物疫病是非常具有可行性，而且利用食線蟲性真菌對寄生性線蟲進行生物防治不但技術難度小，還比較直接有效[3,4]。隨著捕食線蟲性真菌的出現，科學家們利用其與寄生線蟲之間的拮抗作用，進而對家畜胃腸道的寄生性線蟲進行捕殺，從而發現了食線蟲性真菌巨大的潛在應用價值[5,6]。據統計，目前已發現有200多種真菌具有捕食線蟲的能力，真菌可以利用其特殊的結構殺死自由生活線蟲，而且其分布范圍也特別廣泛[7-10]。本研究的目的是利用西北民族大學蔡葵蒸教授課題組分離鑒定并提供的編號為 F088的食線蟲性真菌為材料探究其孢子在不同滲透壓下的萌發情況，以便為今后更好地利用這種捕食線蟲性真菌進行動物寄生線蟲病的防治及相關疫苗的研發提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

食線蟲性真菌Duddingtonia flagrans來自于西北民族大學生命科學與工程學院蔡葵蒸教授實驗團隊，選用的菌株的編號為F088。

1.2 制備培養基

1.2.1 2%麩皮液體培養基(WB) 1000 ml蒸餾水中加入新鮮麩皮20 g，微火煮沸1 h，補足沸騰過程丟失的水分待冷卻后數層紗布過濾并于4℃冰箱過夜取上清液分瓶后121℃，20 min 高壓滅菌備用。

1.2.2 2%水瓊脂培養基（Water Agar，WA）1 000 ml涼開水中加入瓊脂粉20 g，121℃高壓滅菌20 min后傾注于玻璃培養皿中待凝固后，4℃冰箱保存備用。

1.2.3 玉米粉瓊脂培養基 (CMA) 于1 000 ml蒸餾水中加入新鮮玉米粉40 g微火煮沸1 h，補足沸騰過程丟失的水分。數層紗布過濾并置于冰箱（4℃）沉淀12 h，取上清液并調節濃度至0.4 g/L，經121℃，20 min高壓滅菌后傾注于培養皿中凝固后4℃冰箱保存備用。

1.2.4 馬鈴薯瓊脂培養基（PDA） 新鮮土豆去皮切塊后稱取20 g，加入1 000 ml蒸餾水中微火煮沸1 h，補足沸騰過程丟失的水分，冷卻后數層紗布過濾并于4℃冰箱過夜取上清液備用，分瓶后加入2%的瓊脂粉，然后根據需要分別加入0%、5%、10%、20%的NaCl固體從而獲得一個滲透壓的梯度，最后經121℃，20 min 高壓滅菌后，傾注于培養皿中凝固后4℃冰箱保存備用。

1.3 真菌的分離純化

從4℃冰箱中取出保存有菌株編號為 F088的2%的玉米粉瓊脂斜面培養基在無菌條件下使用接種針將適量的菌絲接種于2% WA瓊脂平板培養基的中央位置，然后在25℃的條件下培養1周后挑取分生孢子至0.4%CMA瓊脂平板培養基中連續純化多次，直至獲得食線蟲性真菌F088的純培養物。

1.4 真菌的培養

取出保存有捕食線蟲性真菌F088純培養物的CMA平板，然后在無菌條件下使用接種環或是接種針也可以是無菌的接種刀挑去適量菌絲或是大小合適的瓊脂塊接種到2%麩皮液體培養基中然后放置在搖床上在28℃和160 rmp的條件下培養8 d。8 d后再一次在無菌條件下使用移液管將適量的菌液接入到固體糧食培養基中在28℃的條件下培養21 d。

1.5 孢子的收集

在無菌條件下從糧食培養基中根據需要取出適量的糧食固體放置在一個三角瓶里。首先用長鑷子將糧食盡量夾碎然后向三角瓶中加入配置并高壓好的0.1%的吐溫80直至瓶中的糧食固體完全浸沒為止，然后在震蕩儀上充分震蕩讓菌絲及孢子從糧食表面脫落，充分混勻后用一小燒杯取適量孢子洗脫液然后利用超聲波使孢子和菌絲分離。將超聲處理后的孢子洗脫液裝入10 ml離心管中在離心機上以1 000 r/min離心5 min，此操作需重復3～5次，直到將殘留的吐溫洗凈為止。離心完畢后用移液槍吸取20 ul孢子液在顯微鏡下計數孢子量并計算離心管中孢子的濃度然后根據需要將孢子濃度調節至合適的濃度（1 500個/ml左右為宜），最后將孢子放置在4℃冰箱保存備用（為保證孢子活性要盡快使用）。

1.6 孢子的涂布、培養及計數

用移液槍吸取300 ul孢子液注到制備好的不同滲透壓的PDA平板上并用涂布棒涂勻，每個滲透壓做3個平行編號為1、2、3、4（1號為對照組2、3、4滲透壓依次升高）。然后使用封口膜將9個平板封口最后放置在28℃的培養箱中培養24 h后計數孢子的萌發率。計數孢子時可用刀或是打孔器切去大小合適的PDA瓊脂塊直接在顯微鏡下計數也可經棉蘭染色液染色后再計數。

表1 食線蟲真菌F088分生孢子不同滲透壓下萌發率

2 結果與分析

由表1看出食線蟲真菌F088分生孢子在PDA平板上在28℃的條件下培養24 h后其平均萌發率可達67.35%，同樣的培養條件下在加了5% NaCl的PDA平板上的平均萌發率為3.65%，在加了10%NaCl的PDA平板上的平均萌發率為2.13%，在加了20%NaCl的PDA平板上的平均萌發率僅僅為1.10%，從這幾組數據中可以看到隨著培養基滲透壓的不斷升高孢子的萌發率是明顯降低的。本次實驗結果表明食線蟲真菌F088其孢子的萌發率與培養基中滲透壓的高低有關，在培養基中加了5%NaCl后它的萌發率有非常明顯的降低，由對照組的67.365%下降為3.65%，并隨著培養基中NaC含量的增加即培養基中滲透壓的升高而繼續降低，當培養基中的NaC含量增加至20%是孢子的萌發率僅為1.10%。

3 結語

胃腸道寄生線蟲病是危害家畜健康成長的主要寄生蟲病。隨著寄生線蟲對化學驅蟲藥抗藥性的不斷增強，尋找驅蟲藥的替代或補充方法已經顯得尤為重要，而利用食線蟲真菌對動物寄生蟲的拮抗作用而控制這類動物疫病是目前最有前景的選項。當前已發表的研究成果中有對食線蟲真菌生長及捕食環境的報道，比如對生長溫度的要求、對pH的適應性、對培養基中的養分以及各種離子含量的需求。但是并未見對其孢子在不同滲透壓下萌發情況的研究，本實驗利用D. flagrans中編號為F088的菌株為研究材料對其分生孢子在不同滲透壓下的生長狀況做了一個簡單的探究，對食線蟲真菌的生長條件做了一個簡單的補充，為以后菌株的分離純化培養以及對優質菌株的選擇提供簡要參考。