茶樹根系跨膜吸收氟的生理與分子機制

徐佳佳，廣敏，史書林，郜紅建*

茶樹根系跨膜吸收氟的生理與分子機制

徐佳佳1,2，廣敏2，史書林2，郜紅建1,2*

1. 茶樹生物學與資源利用省部共建國家重點實驗室，安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036；2. 農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，安徽農業大學資源與環境學院，安徽 合肥 230036

茶樹[(L.) O. Kuntze]是高富集氟的植物，氟在葉片中被大量累積。飲茶是人們攝取氟的重要途徑，氟的過量攝入會影響人體健康。茶樹主要通過根系從土壤中吸收富集氟，但是根系跨膜吸收氟的生理與分子機制尚不清楚。本文綜述了茶樹根系吸收氟的主動和被動途徑，總結根系H+-ATPase和Ca2+-ATPase介導氟的跨膜主動吸收過程與分子機制；剖析離子通道和Al-F絡合在根系被動吸收氟過程中的作用及微觀過程；分析影響根系吸收富集氟的主要因素及其調控措施。提出通過研究茶樹根系氟跨膜吸收相關轉運蛋白及其相關基因的克隆、表達和功能驗證，以揭示跨膜吸收氟的分子機制；進而研究調控根系對氟的選擇吸收，以保障茶葉質量安全和飲茶健康。

茶樹根系；氟；跨膜吸收；生理與分子機制；影響因素

氟對人體骨骼和牙齒的生長發育至關重要[1]，適量的氟可以促進骨骼和牙齒的鈣化，增強骨骼強度，但攝入過多會引起氟斑牙、氟骨病等氟中毒癥狀[2]。氟雖然不是植物的必需元素[3]，但是，因茶樹具有高量吸收、轉運和積累氟的特殊機制和能力，可被茶樹大量吸收[4]。葉片中氟的積累量占茶樹全株的98%，尤其是成熟葉和老葉，其含量分別達到500?mg·kg-1和2?000?mg·kg-1以上[5-6]。在沒有大氣氟污染的情況下，根系是茶樹吸收、轉運氟的主要器官[7]，因此，減少根系對氟的吸收，是降低葉片累積氟的重要途徑。已有的研究表明，茶樹根系可以通過主動和被動兩種途徑吸收富集氟[8-9]，其中包括H+-ATPase[10]/Ca2+-ATPase[11]參與的跨膜吸收，Al-F絡合吸收[12-13]，離子通道[4]參與吸收等。這些吸收過程與根細胞膜上的轉運/通道蛋白密切相關，但其生理與分子作用機制尚不明確。本文著重闡述轉運/通道蛋白介導的茶樹根系吸收氟的主動和被動過程及生理與分子機制，為調控茶樹對氟的吸收提供理論依據。

1 茶樹根系吸收的氟形態

茶樹能從土壤中吸收并在體內累積氟[14]，土壤中氟的形態及其有效性是影響茶樹根系吸收氟的主要因素[15]。土壤氟主要以難溶態、交換態和水溶態等形態存在[7]，難溶態和可交換態氟很難被茶樹吸收，水溶態是茶樹吸收富集的主要氟形態[16]，且是土壤溶液中活性最高的氟形態，并以F-、HF2-、H2F3-、H3F4-、AlF63-、FeF63-等離子或絡合物形式存在[17]。研究表明，Al-F絡合物比F-更容易被茶樹根系吸收和轉運到新梢[6,18]，土壤中的Al-F絡合物主要以AlF2+、AlF2+、AlF3形式等被根系吸收，并以AlF2+、AlF2+、AlF4-等形態被木質部運輸[13,19]。Ruan等[19]認為，F-也易被茶樹根系吸收，最終大部分被運輸到葉片，并以F-形式被積累[20]。張顯晨等[21]發現，低濃度Al3+（1.05~5.26?mmol·L-1）條件下，氟主要以F-形態被茶樹根系吸收，并促進氟在根系的富集；高濃度Al3+（10.52~31.57?mmol·L-1）條件下，氟主要以Al-F絡合態被吸收，并抑制了氟的富集。

2 茶樹根系吸收氟的機制

2.1 外界氟濃度影響氟吸收途徑

外界氟濃度決定了其進入根細胞的途徑。當外界低氟質量濃度（0.1~10?mg·L-1），茶樹根系主動吸收氟，吸氟過程不僅符合Michaelis-Menten動力學模型，而且依賴能量，高氟質量濃度范圍內（50~100?mg·L-1），根系被動吸收氟，并隨著氟濃度升高呈線性增長[4,9]。彭傳燚等[9]認為，主動吸收是茶樹根系攝取氟的主要途徑。

2.2 茶樹根系對氟的主動吸收

2.2.1 H+-ATPase介導氟的跨膜主動吸收

茶樹根系吸收氟是一個與跨質膜電化學勢梯度、代謝能量和載體蛋白密切相關的主動運輸過程[10]。離子的跨膜吸收和主動運輸主要依賴質膜H+-ATPase水解ATP在細胞膜內外兩側建立起來的ΔH+（H+濃度梯度）和電化學勢[22]，ΔH+的增加，可以刺激植物吸收營養物質[23]。排出的H+導致質子梯度并產生Δp（質子驅動力），激發根細胞質膜中的質子偶聯轉運蛋白吸收陰離子，如NO3-（NRT1和NRT2轉運蛋白），PO43-（PHT1轉運蛋白），SO42-（SULTR1轉運蛋白），Cl-等[23-25]。被激活的質膜H+-ATPase會增強膜外的電化學勢，驅使離子通過次級運輸系統進入細胞以提高植物對養分的吸收[26]。Zhang等[27]認為，Al3+提高茶樹根系H+-ATPase活性，增加H+的跨膜外排，進而促進了茶樹對氟的吸收。有研究表明，H+-ATPase的水解能增加活性H+轉運[28]。而如果H+-ATPase的水解受到抑制，會減少H+的產生，主動吸收所需的ΔH+合成受阻，從而降低根系質膜內外的Δp，使茶樹根部對氟的吸收和累積不斷減少[10]。因此，H+-ATPase水解和活性的增加是茶樹根系對F-的跨膜主動吸收的驅動力。

2.2.2 Ca2+-ATPase介導氟的跨膜主動吸收

茶樹對氟的吸收與質膜Ca2+泵和鈣轉運ATPase有關，尤其是Ca2+-ATPase（ACAs），同類型ACA9可能參與茶樹氟吸收或氟脅迫的響應[11]。Ca2+-ATPase催化質膜內側ATP水解，釋放能量，驅動Ca2+泵出細胞質。質膜H+-ATPase產生的H+梯度，也可以促進Ca2+泵活動，植物體內Ca2+信號的傳導可調控應激條件下離子跨質膜的選擇吸收[29]。如Ca2+信號調控NFA（尼氟酸）對玉米根莖中陰離子（NO3-、Cl-和I-）的選擇性吸收[30]。Al3+刺激Ca2+跨膜轉運、誘導茶樹根成熟區Ca2+信號，在Al3+處理下CaM（鈣調蛋白）促進氟的吸收[31]。研究表明，茶樹根系質膜Ca2+-ATPase活性被抑制時，引起細胞內Ca2+的外排，產生Ca2+信號，激活CaM，從而促進茶樹對氟的吸收[27]。另有研究認為，氟激發了RLK（類受體蛋白激酶）基因的表達（RLKs是由植物基因組編碼的信號轉導基因的超家族），進而激活了Ca2+-ATPase活性，活化的Ca2+-ATPase可作為茶樹攝取氟的載體促進氟的吸收和轉運（圖1）[11]。

注：RLK在感知氟信號后激活Ca2+-ATPase，Ca2+-ATPase幫助氟進入細胞

Note: The RLKs activate Ca2+-ATPase after perceiving F signals, and Ca2+-ATPase helps F enter into cells

圖1. 氟吸收的假設示意圖

Fig. 1 Hypothetical schematic diagram of fluorine uptake

2.3 茶樹根系對氟的被動吸收

2.3.1離子通道

離子穿過通道是沿跨膜濃度梯度或電位梯度擴散的順勢流動，與利用載體蛋白進行協助擴散相似，但區別于逆電化學勢梯度的主動運輸[32]。在分子水平上，協助擴散由單向轉運體或通道介導[25]。有研究認為，茶樹跨膜吸收氟涉及水通道和陽離子通道，但都不是主要途徑，陰離子通道才是重要途徑之一[4,33]。植物中氟的跨膜轉運位點可能與轉運Cl-的通道有關[34]，Cl-通道是陰離子通道中的主要成員之一，可以介導Cl-、NO3-等陰離子的跨膜轉運[35-37]。保衛細胞中的R型陰離子通道可滲透多種陰離子，且遵循SCN->NO3->Br->F-> I->Cl-的滲透順序；S型陰離子通道除了SCN-不能被滲透，其他均可被滲透[38]。

許多單細胞生物和高等植物在其細胞膜中用氟輸出蛋白來保持細胞質低氟濃度。現已知兩個獨立的氟輸出蛋白家族，CLCF（Cl-通道F-/H+反向轉運蛋白）和Fluc（小膜蛋白家族，又被稱為crcB）[39]。前者是CLC超家族陰離子轉運蛋白的一個亞類，它對F-/Cl-的選擇性有特別強的電壓依賴性，并表現出F-比Cl-較高的選擇性，能從細胞質中逆轉運F-[40-41]；后者傳輸F-是通過跨膜通道進行熱力學被動電擴散[39]。研究發現，氟輸出蛋白家族的F-通道是“單管”轉運蛋白，含有兩個孔，其中孔Ⅱ在F-轉運中起作用[42]。

2.3.2 Al-F絡合吸收機制

鋁是植物組織中氟的最強配體[43]。土壤中水溶性鋁與水溶性氟含量呈顯著正相關，表明土壤中的鋁和氟能夠以絡合形態合作進入茶樹體內[44]。研究表明，AlFn3-n絡合體是茶樹吸收氟的載體，而非運輸形態[45]。Yang等[43]研究發現，茶樹根細胞氟信號在NaF處理下比NaF和AlCl3共同處理強烈，說明氟鋁溶液中的氟形態可能以AlF2+，AlF2+和AlF30等復合物存在，表明氟主要是以Al-F絡合物被根系吸收。張顯晨等[21]認為，高濃度Al3+存在時，茶樹根系吸收主要氟形態是Al-F絡合態。前人研究也證明了土壤中能形成Al-F配合物，更容易被茶樹吸收和運輸，并且AlF3促進了更多的氟吸收和向葉片的轉運[45-46]。我們推測茶樹根系吸收Al-F絡合物可能需要載體蛋白介導，與植物吸收Fe3+需要YS（Yellow Stripe）轉運體介導的螯合機制可能相似[47]。

3 茶樹根系吸收氟的影響因素

3.1 溫度

溫度會影響根系對氟的攝取。當外界溫度低于5℃，茶樹對氟的吸收速率很低；當溫度升到15℃，吸收速率增加約1倍；當溫度達到35℃，吸收速率顯著提高，為5℃時的3倍左右[48]。Zhang等[4]研究表明，茶樹暴露于低溫（5℃）時根系對氟的攝取受到強烈抑制，高溫（35℃）時根系對氟的吸收量顯著提高。王玉梅等[10]認為，低溫（4℃）可能抑制了茶樹根系質膜H+-ATPase活性，阻礙ATP的合成，減少水解產生的H+，降低質膜內外的質子驅動力，從而削弱茶樹根系吸收氟的過程。

3.2 pH

pH被認為是影響茶樹根系吸收氟的主要因素，因為pH顯著影響土壤的氟形態，其中對水溶態氟和可交換態氟的影響最大[49]。謝忠雷等[16]認為，茶樹對土壤中氟的吸收量與pH呈顯著負相關，酸性土壤中的氟更易被吸收。Ruan等[50]研究表明，當培養溶液pH值在4.0~6.0范圍內，茶樹根系氟吸收量隨著pH的升高先增加后減少，在pH 5.5時達到最大值，pH 4.0時較低。Zhang等[4]認為，在外界低氟濃度（18?μmol·L-1）下pH影響凈F-吸收，pH 2.0和pH 5.0時的凈F-吸收速率顯著大于pH 4.0和pH 6.0，而更高氟濃度（43、150?μmol·L-1）下凈F-吸收不受pH的影響。

3.3 陪伴離子

實際上，促進離子吸收的轉運蛋白很少是特異性的，相同價態的離子之間競爭進入通道或結合載體蛋白是常見的[25]。王玉梅等[10]研究表明，氯降低茶樹對氟的吸收，可能與Cl-與F-競爭同一載體的吸附位點有關。這與Calvo-Polanco等[51]觀點一致，他認為Cl-可能對F-的吸收轉運具有競爭性抑制作用，同時會干擾Cl-的膜轉運。Ruan等[19]也認為，氟的吸收受氯的負面影響。除陰離子的影響外，陽離子也影響根系對氟的吸收，其中Al3+顯著影響茶樹中氟的吸收和轉運，鋁處理（≤0.5?mmol·L-1AlCl3）增加了根系中氟的含量，但降低了葉片中氟的含量[43]。Ca2+降低茶樹的氟吸收及葉片氟含量，不僅僅是由于溶液和土壤中的CaF2沉淀或根中Ca-F絡合物，更可能是因為Ca2+改變了茶樹根系細胞壁結構和細胞膜滲透性，以及土壤溶液中氟形態及其數量，進而影響氟進入茶樹體內[13,50,52]。

3.4 代謝抑制劑

陰離子通道代謝抑制A-9-C（劑蒽-9-羧酸），CCCP（羰基氰化物間氯苯腙）強烈抑制茶樹對F-的吸收，而DIDS（二氫-4,4'-二異硫氰基芪-2,2'-二磺酸）對F-的吸收沒有顯著影響[4]。但Zhang等[27]研究發現，DIDS顯著減弱了Al3+促進茶樹對氟的積累，并且Ca2+和CaM也顯著降低。另外，Ca2+-CaM和質膜電位去極化參與了NPPB[5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸]抑制茶樹氟的積累[53]。這些結果表明離子通道抑制劑可以通過關閉陰離子通道而降低茶樹對氟的吸收和積累。

4 研究展望

目前，有關報道茶樹降氟措施的研究多側重于栽培、加工、施肥等方面，而從分子機制方面研究降低茶樹根系吸收氟的甚少。本文綜述了茶樹根系吸收氟的4種可能途徑，即H+-ATPase或Ca2+-ATPase介導的跨膜主動吸收，離子通道蛋白和Al-F結合共轉運的被動吸收，但其吸收過程和分子機制尚不清楚。

4.1 膜蛋白介導茶樹根系吸收氟的機制

Ca2+-ATPase介導茶樹吸收氟的RLK基因已被報道[11]，一些質膜H+-ATPase基因也已經被鑒定與植物營養元素吸收有關。例如，玉米體內與NO3-攝取有關的和基因[54]，水稻中參與磷的獲取和轉運的同種型基因[55]等。但是H+-ATPase介導的茶樹吸收氟的相關基因目前還沒有文獻報道。研究表明，氟會提高茶樹根系H+-ATPase活性[56]，該酶活性的增加可能會促進茶樹根系對氟的吸收，氟還可抑制玉米根系H+-ATPase[57]和酵母質膜H+-ATPase[58]活性，而該酶活性的變化部分地由該酶基因的表達模式變化引起[59]。因此，利用分子生物學手段，研究茶樹跨膜吸收氟相關轉運蛋白的作用及其基因的克隆和表達分析，將主效基因轉化到煙草/擬南芥中進行功能驗證，以揭示茶樹跨膜吸收氟的分子機制，調控茶樹根系對氟的選擇吸收。此外，突破轉基因茶樹品種的選育及表達體系構建的障礙，為研究茶樹根系跨膜吸收氟的分子機制提供試驗材料，將是今后努力的重要方向。

4.2 調節茶樹根系吸收氟的措施

按照農業部制定的行業標準（NY 659—2003），茶葉氟含量（F-）不能超過200?mg·kg-1。茶樹新梢氟含量在100~300?mg·kg-1[60]，成熟葉和老葉已經嚴重超標[5-6]。減少茶樹根系對土壤氟的吸收富集是調控茶葉氟含量的重要措施，已有的研究多采用施肥，調節pH，添加生石灰和生物質炭改良劑等措施降低土壤氟的生物有效性，減少茶樹對土壤氟的吸收富集[50,61-62]。但是，這些調控措施是否會影響茶樹對其他營養元素的吸收，是否會影響茶葉中氨基酸、咖啡堿等次生代謝物質的含量及茶葉品質，目前還不清楚，值得進一步研究。此外，選育低氟茶樹品種也是生產低氟茶葉產品的有效途徑。

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Physiological and Molecular Mechanisms of Transmembrane Fluoride Uptake by Tea Roots

XU Jiajia1,2, GUANG Min2, SHI Shulin2, GAO Hongjian1,2*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science and Technology of Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Anhui Province Key Laboratory of Farmland Ecological Conservation and Pollution Prevention, School of Resources and Environment of Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China

Tea plant is a fluoride hyper-accumulator and most of fluoride is accumulated in the leaves. Drinking tea is an important way to absorb fluoride for human, which affects human health. Fluoride is usually absorbed from the soil by tea roots. However, the physiological and molecular mechanisms of transmembrane fluoride uptake by the tea roots were still poorly documented. Therefore, this paper reviewed the active and passive pathways of fluoride uptake by the roots of tea. The active transmembrane uptake fluoride process and molecular mechanism by H+-ATPase and Ca2+-ATPase, the role and microscopic process of ion channel and Al-F complexation by passive fluoride uptake were analyzed. The main influencing factors and control measures of fluoride accumulation in tea roots were also investigated. In order to reveal the molecular mechanism of transmembrane fluoride uptake, regulate the selective fluoride uptake in tea roots, and ensure the tea quality and safety for consumption, cloning, expression, and functional verification of transport proteins and genes related to fluoride transmembrane uptake in tea plant should receive more attention in future studies.

tea roots, fluoride, transmembrane uptake, physiological and molecular mechanism, influencing factor

S571.1

A

1000-369X(2019)04-365-07

2019-01-17

2019-03-22

安徽省自然科學基金（1808085QC56）

徐佳佳，女，碩士研究生，主要從事茶樹吸收氟元素的生理與生物學方面的研究。*通信作者：hjgao@ahau.edu.cn