茶樹谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因CsGPX1功能分析

劉賽，劉碩謙,3，龍金花，吳敦超，陳宇宏，劉麗萍，劉仲華,3，田娜,3*

茶樹谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因功能分析

劉賽1,2，劉碩謙1,2,3，龍金花1,2，吳敦超1,2，陳宇宏1,2，劉麗萍1,2，劉仲華1,2,3，田娜1,2,3*

1. 湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 教育部茶學重點實驗室，湖南 長沙 410128

為明確茶樹[(L.) O. Kuntze.]谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）編碼基因的功能，本文利用茶樹轉錄組數據克隆獲得的編碼區全長序列，進行序列比對與分析，在此基礎上，將在煙草中進行過表達獲得轉基因煙草，并比較野生型煙草與轉基因煙草耐旱性的差異，驗證功能。序列分析表明，編碼序列（CDS）長723?bp，編碼240個氨基酸。BLAST比對發現，該基因與桃樹（）的基因具有高度同源性（>85%）。編碼的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列和區別于其他家族成員的特有的結構域——磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPX）。干旱脅迫處理結果顯示，過表達煙草株系抗旱性強于野生型。GPX酶活性測定結果表明，轉基因植株的GPX酶活性高于野生型植株。以上研究結果表明，過表達可提高轉基因煙草的耐旱能力，說明可能與茶樹的耐旱性能相關。本研究為提高茶樹的耐旱性能研究提供了新的理論途徑，并對降低茶園管理的成本具有一定的積極意義。

茶樹；谷胱甘肽；過氧化物酶；非生物脅迫；抗旱機理

植物在正常的新陳代謝過程中，在體內會不斷產生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。而在低溫、鹽堿、干旱等逆境脅迫時，植物體內ROS含量會迅速上升。若植物體內的ROS上升到一定程度，將會使植物受到傷害[1]，嚴重時會導致植物死亡。為應對逆境產生的氧化脅迫，植物細胞存在兩種機制，即非酶促反應與酶促反應[1]，來平衡ROS的正常水平，減少ROS造成的損傷。酶促抗氧化系統中，抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）、過氧化物酶（Peroxidases，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）等在保護植物細胞免受氧化損傷過程中扮演重要的角色[2]。

GPX是生物機體內重要的抗氧化酶，它通過清除機體內的活性氧自由基，使活性氧自由基對機體的損傷被阻斷，使細胞免受氧化脅迫，從而增強植物的抗逆能力。GPX能調節植物脅迫適應性，可以作為信號分子，與激素交聯，參與植物的生長發育[2]。已有研究表明，植物GPX是一個包含多種同工酶的家族，其中磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPX）屬于家族中的獨特成員，KWNF（E/T/A/S）KFLV是PHGPX區別于其他家族成員的特有的結構域。PHGPX具有特異性地還原膜上磷脂氫過氧化物的功能，其參與細胞凋亡信號調控，可以保護DNA、磷脂、膽固醇等[3]。因此，通常認為合成GPX酶的相關基因是非常重要的抗逆相關基因。所以研究這些基因的功能對進一步理解植物抗逆機理，以及抗逆基因工程的改良等都具有重要意義。

植物體內基因最初從煙草中克隆出來，之后又有學者相繼從擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[6]、柑橘[7]、菠菜[8]、鹽芥[3]等植物中克隆和鑒定了植物基因。肖蓉等[1]研究發現，在植物干旱和鹽脅迫時，棗樹基因在其脅迫反應機制中發揮重要作用，過量表達基因有助于提高轉基因擬南芥的耐旱、耐鹽能力。王菲菲等[9]研究發現，過量表達胡楊基因可顯著提高煙草的耐鹽性。陳義挺[10]研究表明，GPX活性變化與龍眼胚性細胞抗逆性具有正相關關系，其活性變化可作為植物在逆境脅迫下減輕ROS傷害的重要標志之一。

茶樹[(L.) O. Kuntze.]是我國一種古老而重要的經濟作物，其的研究報道尚少。喬新榮等[11]研究發現茶樹基因在干旱脅迫反應中發揮著重要作用，但對在茶樹抗逆方面分子機理的研究還不夠深入。隨著目前分子技術的迅速發展，通過分子技術育種已然是一種行之有效的途徑，選擇培育抗逆性強的茶樹良種意義重大[12]。并且通過基因工程提高作物的抗逆性是目前作物遺傳轉化研究的熱點，所以本研究將對于指導培育茶樹抗逆新品種具有重要意義。

本課題組前期比較轉錄組學研究發現，干旱處理的茶樹中基因表達水平急劇升高（數據未發表），為此我們推測可能具有抗旱的功能。為進一步驗證的功能，本研究利用茶樹轉錄組數據獲得了編碼區全長序列，并對該序列進行生物信息學分析，預測其功能。在此基礎之上，構建了植物表達載體，運用農桿菌介導法，將轉入煙草，而后不斷自交直至獲得T3代種子，以此為材料進行干旱脅迫試驗，并進行GPX酶的活性測定，深入分析該基因的功能。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與培養條件

本試驗所用的茶樹材料來自湖南農業大學校內茶園基地，采摘其芽頭立即用液氮處理3?min，于–80℃超低溫冰箱保存。煙草培養條件為室溫(25±1)℃，12?h光照周期，相對濕度60%~80%。

1.2 化學試劑及試劑盒

試驗所用的主要化學試劑均為分析純，購于長沙試劑公司；pCXSN植物表達載體由美國俄亥俄大學王國梁教授構建[13]；谷胱甘肽過氧化物酶測試盒購自南京建成生物工程研究所；first-strand cDNA synthesis kit，Prime STAR HS DNA Polymerase，TaKaRa MiniBEST Agrose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，DNA A-Tailing Kit和T4 DNA Ligase等購于Takara公司；Free DNase Set試劑盒購于Qiagen公司。

1.3 總RNA提取及反轉錄

根據Tri-Reagent試劑盒說明書提取總RNA，用Free DNase Set試劑盒去除DNA。用Nanodrop 2000檢測總RNA濃度和質量。取1?μL RNA，通過凝膠電泳測定RNA樣品的純度及完整性。根據Takara cDNA第一鏈合成試劑盒，以茶樹葉片RNA為模板，逆轉錄合成cDNA第一鏈。

1.4 CsGPX1基因擴增

根據基因的cDNA序列使用Primer 5軟件設計引物擴增ORF序列，引物由上海生物工程技術有限公司合成。用Prime STAR HS DNA Polymerase進行PCR擴增。擴增引物：上游引物GPXOF：5'-ATGGCTTCTTCCTCTTCA-3'；下游引物GPXOR：5'-AAACTCGTTGCAGCA-3'。擴增程序為：98℃變性10?s，55℃退火5?min，72℃延伸1.5?min，循環30次。

1.5 CsGPX1的生物信息學分析

采用Clustal W軟件進行序列比對，采用DNAMAN和BioEdit軟件進行ORF（Open reading frame）翻譯、蛋白質基本性質等分析，GenBank BLAST和蛋白質序列的CDD搜索在NCBI網站上進行，運用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam）在線預測氨基酸的組成與理化性質。

1.6 CsGPX1植物過表達載體構建

利用TaKaRa切膠回收試劑盒回收目的片段，并連接A尾，將加了A尾的基因片段與XcmI酶切后的pCXSN質粒用T4連接酶進行連接反應。連接體系具體如下：載體片段：50~60?ng，目的片段：150?ng，T4-DNA Ligase：0.5?μL，T4-DNA Ligase Buffer：2?μL，ddH2O定容至20?μL。16℃下連接過夜，連接產物用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5。通過菌落PCR驗證，陽性菌落進一步送至上海生物工程技術有限公司測序驗證。測序驗證正確的菌落，通過液體培養并提取質粒，測序驗證。

1.7 CsGPX1過表達載體的煙草轉化

用凍融法將重組質粒pCXSN-CsGPX1轉入農桿菌GV3101中[14]，然后通過農桿菌介導將重組質粒pCXSN-CsGPX1采用葉盤法轉化煙草[15]。侵染后的外植體置于1/2MS固態培養基上進行共培養，誘導不定芽的生成（培養基含1/2MS+1?mg·L-16-BA+0.15?mg·L-1NAA +400?mg·L-1頭孢霉素+60?mg·L-1潮霉素）。待長出抗性芽后，進行生根誘導培養（培養基含1/2MS+0.15?mg·L-1NAA+400?mg·L-1頭孢霉素+15?mg·L-1潮霉素）。生根一周后移栽至營養土中培養。

1.8 轉基因煙草的鑒定及純化

用CTAB法[16]提取轉基因煙草基因組DNA，PCR法驗證目的基因是否成功轉入煙草。陽性煙草植株進行自交，獲得T0代種子，滅菌后均勻撒在含有60?mg·L-1潮霉素的1/2MS篩選培養基上，待煙草長出兩片真葉后轉入營養土中進行培養，并采用PCR進行驗證，收集PCR陽性結果的煙草種子，重復上述篩選方法，直至得到轉基因煙草純合體（T3代）。

1.9 CsGPX1過表達植株抗旱試驗

將野生型煙草（WT）和轉基因煙草植株的T3代種子（分為O1、O2、O3三組）均勻撒在墊有潤濕濾紙的玻璃培養皿中，于25℃培養。待煙草長出兩片真葉時，移栽至營養土中繼續培養，每組8株，共32株。待長勢穩定時，澆水至飽和，采用不澆水的處理開始進行干旱脅迫。待所有株系都表現出葉片黃化、萎蔫時，加水至飽和狀態。如此重復操作，使煙草處于干旱環境。觀察煙草恢復活性的情況，并拍照記錄。

1.10 過表達CsGPX1煙草植株生理生化指標測定

生理生化指標測定參照李合生的方法[17]，谷胱甘肽過氧化物酶活性用谷胱甘肽過氧化物酶測試盒測定。

1.11 數據分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Origin 2017進行數據分析。干旱脅迫處理結果使用T檢驗分析統計學顯著性差異；GPX酶活測定結果使用單因素方差分析方法分析。

2 結果與分析

2.1 CsGPX1基因克隆

根據轉錄組序列設計引物，PCR擴增獲得目的基因。序列分析表明，該基因含有1個長度為723?bp的ORF，編碼240個氨基酸（圖1）。

圖1 CsGPX1的核苷酸序列和氨基酸序列

2.2 蛋白序列的同源性分析及系統發育分析

為了預測基因的功能，采用NCBI BLASTP進行序列同源性分析，并用MEGA 4.1將該基因的氨基酸序列與其他物種的GPX氨基酸序列比對分析，結果如圖2所示。編碼的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列——3個保守結構域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）：VNVAS（K/R/Q/E）CGLT，LAFPCNQF和KWNF（E/T/A/S）KFLV，并且KWNF（E/T/A/S）KFLV是區別于其他家族成員的PHGPX特有的結構域；GPX同工酶含有3個保守半胱氨酸（C）殘基催化位點，其中前兩個分別位于第Ⅰ、第Ⅱ結構域內，第3個位于結構域外（圖2的黑三角）[2-3]。由編碼的氨基酸序列與其他植物GPX氨基酸序列系統進化樹（圖3）可知，編碼的氨基酸序列與月季（、XP_024162855.1）、桃樹（、XP_007223774.1）和歐洲甜櫻桃木（、XP_021821043.1）的GPX氨基酸序列的親緣關系比較近。

2.3 編碼蛋白質結構分析

運用ProtParam tool在線預測CsGPX1蛋白的氨基酸組成與理化性質，結果顯示，CsGPX1的預測分子式為C1205H1844N306O349S6，分子量為26.394?1?kD，理論等電點（pI）為9.31，負電荷殘基Asp和Glu分別為9個和10個，正電荷殘基Arg和Lys分別為4個和24個。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區域表示GPX的保守結構域；▼表示GPX酶的活性中心殘基。CoGPX：長蒴黃麻，OMO90689.1；PpGPX1：桃樹，XP 007223774.1；JcGPX1：麻風樹，NP 001292953.1；PeGPX1：胡楊樹，NP 001306722.1；QsGPX1：栓皮櫟，XP 023923965.1；RcGPX1：月季，XP 024162855.1

注：M：Trans 100 bp Plus II DNA Ladder，P：CsGPX1基因

2.4 CsGPX1過表達載體檢測

以茶樹葉片的cDNA作為模板，在高保真酶的作用下，通過特異性引物擴增出了基因，目的基因的片段大小在750?bp左右（圖4），擴增產物為明亮、單一條帶，符合預測結果。用XcmI酶對pCXSN質粒進行酶切，將長片段切膠回收，利用T4連接酶與目的片段進行連接，獲得過表達載體pCXSN-CsGPX1。通過熱激法將重組質粒轉入大腸桿菌DH5，挑選單一菌落，菌落PCR驗證采用特異性引物對（GPXOF/CXSNOF）進行，挑取陽性克隆進行測序，測序結果表明pCXSN-CsGPX1載體序列正確。

2.5 過表達CsGPX1煙草植株篩選與驗證

用CXSNOF/CXSNOR引物進行驗證pCXSN-CsGPX1載體轉化農桿菌GV3101是否成功。2~6的泳道中（圖5）均為明顯單一的條帶，用質粒轉化農桿菌的泳道7中沒有條帶，結果表明過表達載體pCXSN-CsGPX1已經成功導入農桿菌GV3101中。

以野生型煙草的總DNA為對照，以轉基因煙草的總DNA為模板，通過特異性引物對（GPXOF/CXSNOF）進行PCR檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，野生型煙草泳道（2）無特異性條帶，而轉基因煙草泳道（3~8）（圖6）出現明亮、單一的特異性條帶，大小在750?bp左右，結果完全符合試驗預期，由此說明基因已經成功導入煙草中，即成功得到了轉基因陽性植株。

注：M：100 bp Plus II DNA Ladder，P：基因

Note: M:100 bp Plus II DNA Ladder. P:Gene

圖4基因PCR 擴增電泳

Fig. 4 The electrophoresis analysis of PCR amplification production of

2.6 過表達CsGPX1煙草植株抗性結果分析

在野生型和轉基因煙草苗成株期進行干旱脅迫后，如圖7-A結果所示，野生煙草植株開始表現出葉片黃化、萎蔫，而轉基因煙草株系生長基本正常。且野生型煙草植株與轉基因株系相比，其植株矮小。干旱脅迫進行到如圖7-B時，所有株系都表現出葉片黃化、萎蔫。此時，給所有植株澆水至飽和。結果如圖7-C所示，轉基因煙草株系87.5%恢復活性，而野生型煙草株系只有12.5%恢復活性。過表達煙草植株（O1—O3）和野生型煙草植株（WT）經干旱脅迫后恢復活性植株的數量統計如圖8所示，與對照組相比，轉基因組植株復活數量具有極顯著性差異（<0.01）。由上可證明過表達煙草耐旱性明顯提高。

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2~6：重組質粒轉化農桿菌GV3101；7：用質粒轉化的農桿菌

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2：野生型煙草DNA；3~8：轉基因煙草DNA

注：A：葉片開始萎蔫；B：葉片全部萎蔫；C：葉片恢復活性

注：使用T檢驗分析統計學顯著性差異（**：同WT組比較，差異極顯著，P＜0.01）

2.7 過表達CsGPX1煙草植株GPX活性測定結果與分析

對過表達煙草植株的GPX酶活性進行測定，結果如圖9所示。從圖中可以看出3組轉基因株系O1—O3的GPX活性都高于野生型株系WT；其中轉基因株系O1的酶活性最高，達野生型株系WT的4.4倍，統計分析結果表明具有極顯著性差異（<0.01）。

3 討論

植物GPX是一個包含有多種同工酶的家族，這些同工酶在酶學特點、一級結構、亞基結構和亞細胞定位上顯著不同，但都具有高度保守區域[18]。研究表明，GPX在植物體內可能具有多個家族成員，在不同的環境條件、樹種、組織里每個家族成員可能表現出不同的表達水平和表達模式[8]。有研究發現在擬南芥中存在8個GPX酶的基因序列（AtGPX1—AtGPX8）[19-20]。本研究克隆并獲得了茶樹基因，通過蛋白序列的同源性分析及系統發育分析發現，其所編碼的氨基酸序列具有植物GPX的3個特征保守結構域，并且具有區別于其他家族成員的PHGPX特有的結構域，同時也含有GPX活性中心的3個保守的半胱氨酸殘基，因此，本研究所克隆的基因編碼的蛋白屬于植物GPX家族成員。

注：**同WT組比較：P＜0.01差異極顯著

有研究[21]發現，在受到機械損傷脅迫時，過表達的轉基因植物比對照組受到的影響小；而當受到病菌感染時，與對照相比，過表達的轉基因植物的壞死病灶更顯著增加。該研究表明，當植物受到非生物脅迫時，過表達減緩了非生物脅迫給植物帶來的傷害；然而，當植物受到生物脅迫時，過量表達抵消了植物自身的防御反應并增加了植株死亡的發生[21]。本研究對獲取的轉基因煙草株系進行干旱脅迫處理，結果顯示，過表達株系具有良好的耐旱性。這對于進一步探索基因以及茶樹GPX家族的生物學功能、非生物抗性機理與茶樹抗逆基因改良工程中的利用具有重大意義。

GPX是抗氧化酶體系中的重要成員，可催化谷胱甘肽（GSH）轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時也可以促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不遭受損害[22]。有研究發現，茶樹的抗性與體內可溶性糖含量有關，并且可溶性糖含量增加可引發一系列的生理代謝反應，在一定程度上，隨著可溶性糖的含量增加，植株對環境的適應能力增強[23]。植物的光合作用對逆境反應敏感，光合作用的強弱對于植物生長、產量都有重要影響[24]。過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是植物抗氧化防御系統中最重要的保護酶，是以鐵卟啉為輔基的酶類[25-26]。CAT和POD可以將活性氧分解為氧氣和水，從而減少體內的活性氧積累，使植物免受其毒害。

本研究也對過表達基因的煙草進行了與抗逆相關生理生化檢測，包括其可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性及GPX酶活性的測定。結果表明，轉基因煙草的這些生理生化指標測定結果都高于野生型煙草；但可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性的測定結果沒有顯著性差異，而GPX酶活性的測定結果表明，轉基因株系O1的酶活性最高，是野生型株系WT的4.4倍，具有極顯著性差異（<0.01）。但是，抗性試驗數據（圖8）與酶活性試驗數據（圖9）表現趨勢并不完全一致，我們推測出現這種情況可能是因為本試驗中轉基因煙草除了本身所含內源GPX酶之外還含有通過轉基因獲得的CsGPX1酶，而CsGPX1酶在轉基因煙草中穩定存在，可能是使轉基因煙草抗旱性能提高的主要原因，但是內源僅僅在干旱脅迫之后誘導表達，且內源基因表達時期存在個體差異，因此有些樣品檢測到的是內源基因表達高峰期，有些樣品檢測到的是表達低峰期，導致酶活性測定數據與抗旱結果不能完全一一對應，但具體機制需進一步研究。綜上所述，我們可以進一步推斷，基因的轉入增強了煙草的非生物抗性，說明基因具有提高茶樹非生物抗性的功能。但是，在非生物逆境下的具體機制，尚需更進一步的研究探索。

[1] 肖蓉, 慧珍, 張小娟, 等. 干旱和鹽脅迫條件下棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因（）的差異表達及功能分析[J]. 中國農業科學, 2015, 48(14): 2806-2817.

[2] 喬新榮, 張繼英. 植物谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)研究進展[J]. 生物技術通報, 2016, 32(9): 7-13.

[3] 馬亭亭, 周宜君, 高飛, 等. 鹽芥谷胱甘肽過氧化物酶基因（）的克隆及表達分析[J]. 植物遺傳資源學報, 2012, 13(2): 252-258.

[4] Sugimoto M, Sakamoto W. Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene frominduced by oxidative stress [J]. Genes & Genetic Systems, 1997, 72(5): 311-316.

[5] Li W J, Feng H, Fan J H, et al. Molecular cloning and expression of a phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase homolog in[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1493(1/2): 225-230.

[6] Depege N, Drevet J, Boyer N. Molecular cloning and characterization of tomato cDNAs encoding glutathione peroxidase-like proteins [J]. European Journal of Biochemistry, 1998, 253(2): 445-451.

[7] Avsian-Kretchmer O, Eshdat Y, Gueta-Dahan Y, et al. Regulation of stress-induced phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase expression in citrus [J].Planta, 1999, 209(4): 469-477.

[8] Sugimoto M, Furui S, Suzuki Y. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase from spinach [J]. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 1997, 61(8): 1379-1381.

[9] 王菲菲, 丁明全, 鄧澍榮, 等. 胡楊谷胱甘肽過氧化物酶基因的克隆及轉化植株耐鹽性分析[J]. 基因組學與應用生物學, 2012, 31(3): 231-239.

[10] 陳義挺. 龍眼體胚發生過程中的48和基因克隆與表達[D]. 福州: 福建農林大學, 2009.

[11] 喬新榮, 張繼英. 茶樹基因克隆及干旱脅迫下的表達分析[J]. 江蘇農業科學, 2018, 46(8): 42-44.

[12] 譚和平, 周李華, 錢杉杉, 等. 茶樹轉基因技術研究進展[J]. 武漢植物學研究, 2009, 27(3): 323-326.

[13] Chen S, Songkumarn P, Liu J, et al. A Versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics [J]. Plant Physiology, 2009, 150(3): 1111-1121.

[14] Lazo G R, Stein P A, Ludwig R A. A DNA transformation-competentgenomic library in[J]. Biotechnology. 1991, 9(10): 963-967.

[15] 趙東, 劉祖生, 陸建良, 等. 根癌農桿菌介導茶樹轉化研究[J]. 茶葉科學, 2001, 21(2): 108-111.

[16] 張金麗, 張羅霞, 楊坤梅, 等. 改良CTAB法對山茶屬植物基因組DNA提取的比較研究[J]. 江西農業大學學報, 2017, 39(4): 785-791.

[17] 李合生. 現代植物生理學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 100.

[18] Faltin Z, Holland D, Velcheva M, et a1. Glutathione peroxidase regulation of reactive oxygen species level is crucial for in vitro plant differentiation [J]. Plant Cell Physiology, 2010, 51(7): 1151-1162

[19] Gaber A, Ogata T, Maruta T, et al. The Involvement ofglutathione peroxidase 8 in the suppression of oxidative damage in the nucleus and cytosol [J]. Plant and Cell Physiology, 2012, 53(9): 1596-1606.

[20] Milla M, Maurer A, Huete A R, et al. Glutathione peroxidase genes inare ubiquitous and regulated by abiotic stresses though diverse signaling pathways [J]. The Plant Journal, 2003, 36(5): 602-615.

[21] Herbette S, Labrouhe D T, Drevet J R, et al. Transgenic tomatoes showing higher glutathione peroxydase antioxidant activity are more resistant to an abiotic stress but more susceptible to biotic stresses [J]. Plant Science, 2011, 180(3): 548-553.

[22] 齊增園, 陶鵬, 李必元, 等. 白菜谷胱甘肽過氧化物酶基因的鑒定與分析[J]. 浙江農業學報, 2016, 28(01): 64-69.

[23] 徐澤, 胡翔, 鄧敏. 干旱脅迫對茶樹的幾種抗旱性生理指標的影響[C]//中國茶葉學會, 臺灣茶協會. 第四屆海峽兩岸茶業學術研討會論文集. 2006: 113-118.

[24] 張進. 泛素基因在煙草耐鹽性中的作用及其生理機制研究[D]. 泰安: 山東農業大學, 2009.

[25] 蔡永智. 轉和基因棉花抗旱性分析[D]. 石河子: 石河子大學, 2013.

[26] 杜世章, 代其林, 劉婷婷, 等.60Coγ射線輻照對轉基因和非轉基因煙草抗氧化酶活性的影響[J]. 核農學報, 2011, 25(3): 456-460, 497.

Functional Analysis of Glutathione Peroxidase Encoding Genein

LIU Sai1,2，LIU Shuoqian1,2,3，LONG Jinhua1,2，WU Dunchao1,2，CHEN Yuhong1,2，LIU Liping1,2，LIU Zhonghua1,2,3，TIAN Na1,2,3*

1. College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 3. Key Lab of Tea Science, Ministry of Education, Changsha 410128, China.

To clarify function of glutathione peroxidase-encoding genein(L.) O. Kuntze, the full-length sequence of the coding region ofwas obtained by transcriptome data of tea plant, and sequence analysis and function prediction were performed. Then, thewas overexpressed in tobacco. Subsequently, the difference in drought tolerance between wild-type and transgenic tobacco was compared to verify the function of. Sequence analysis indicates thatwas 723?bp in length, encoding 240 amino acids. The Blast alignment reveals that theshowed more than 85% of identity in amino acid withfrom. The amino acid sequence encoded byhas a conserved characteristic sequence of the GPX protein and a phospholipid hydrogen glutathione peroxidase (PHGPX) which is unique to other family members. The results of drought stress treatment show that the drought resistance of the over-expressing ofin tobacco lines was stronger than that of wild-type. The results of GPX enzyme activity assay show that the GPX enzyme activity of the transgenic plants was higher than that of the wild type plants. All of above results verify that the over-expression ofimproved the drought tolerance of transgenic tobacco, suggesting thatmight be related to the drought resistance in tea plants. This study could provide a new strategy to improve the drought resistance of tea plants, which would significantly reduce the management cost of tea plantation.

, glutathione, peroxidase, abiotic stress, drought resistance mechanism

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)04-382-10

2019-03-08

2019-04-15

國家自然科學基金（31670689）、湖南省重點研發計劃（2018NK2032）

劉賽，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學方面的研究，liusai0417@foxmail.com。 *通信作者：tianna5678@163.com