香茅醇不同旋光異構體對抑制茶炭疽病病菌活性的比較及其協同作用

向曉龍，楊文，劉惠芳，陳瑤，周玉鋒，胡安龍*

香茅醇不同旋光異構體對抑制茶炭疽病病菌活性的比較及其協同作用

向曉龍1，楊文2*，劉惠芳2，陳瑤2，周玉鋒2，胡安龍1*

1. 貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農業科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006

采用菌絲生長速率法、Horsfall方法和共毒系數法測定了香茅醇不同構型對茶炭疽病病菌（）的毒力以及兩構型不同比例混配的協同效應。結果表明，右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶樹炭疽病菌的EC50分別為(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1。按照質量比1.6︰1將右旋香茅醇和左旋香茅醇混配，協同增效作用最高，共毒系數為130.19；質量比為1︰1.4和1︰3.8時，共毒系數分別為120.57和121.42，也具有協同增效作用。結果表明，香茅醇及兩旋光異構體對抑制茶炭疽病菌具有良好的活性，將兩者按一定比例混用后具有增效作用。

植物源農藥；香茅醇；茶炭疽病

茶炭疽病是我國茶園中常見的主要病害之一，在高溫高濕天氣發病較重，在茶葉上可形成大型斑塊，并造成茶樹大量落葉，該病可使投產茶園秋茶減產15%~30%，嚴重的達到40%~50%，造成茶樹產量與茶葉品質都下降[1]。茶樹上登記防治茶炭疽病的殺菌劑有吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、多抗霉素和代森鋅等[2-4]，施用化學農藥是目前防治茶炭疽病的主要手段。目前世界各茶葉進口國加強了茶葉農藥最大殘留的限制，使得防治茶樹病害的化學農藥不宜使用。隨著我國化學農藥減施增效戰略實施和茶葉產業的國際化、現代化、標準化的推進，茶園減施，甚至不施化學農藥也將成為必然趨勢。為了有效減少化學農藥的使用，利用植物體內的次生代謝物質對茶樹病害進行防控是有效的防治途徑之一，其中利用蘆柑皮、艾蒿等提取物及山蒼子等植物精油來抑制茶炭疽病成為研究熱點[5-7]。

香茅醇（Citronellol）來源于天然植物，是由兩種異戊二烯單元（C6H8）組合產生的單萜烯類化合物，具有很好的環境兼容性。香茅醇在芳香類植物的植物精油中普遍存在，例如天竺葵和其他芳香類植物[8]。香茅醇對許多植物病原菌均具有抑制作用，表明其在植物源農藥開發上具有潛力。香茅醇化學名稱：3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇，由于它具有不對稱性，存在-和-兩個旋光異構體[9]（圖1）。

圖1 香茅醇旋光異構體

Fig.1Citronella rotatory isomer

香茅醇在植物病原菌活性的研究方面，Hsouna等[10]測定了天竺葵精油中主要的化學成分和抗菌活性，抗菌的主要化學成分是香茅醇和香葉醇等；吳建挺等[11]測定了天竺葵精油對6種植物病原真菌的抑菌活性，采用GC-MS分析后，明確了主要成分為香茅醇；蔣小龍等[12]報道了香茅精油、香茅醛和香茅醇對6種儲糧霉菌的抑菌作用，其中香茅醇的抑菌效果明顯高于香茅精油和香茅醛的；趙麗靜[13]報道了香茅醇對黃瓜菌核病菌和番茄灰霉病菌等9種病原菌有一定的抑菌作用；Pereira等[14]研究香茅醇對14株紅色毛癬菌的最低抑制濃度（MIC）值在8~1?024?mg·L-1，對多株菌種的MIC值為128?mg·L-1；李曉晴等[15]報道了-香茅醇抗念珠菌活性的體外研究，-香茅醇對61株念珠菌的MIC范圍為81.39~1?342.39?μg·mL-1。林霜霜等[16]報道了檸檬天竺葵精油主成分為-香茅醇約占32.21%，在800?mg·L-1時對番茄早疫病的抑制率達63.24%。

多數農藥旋光異構體存在活性差異，其中一半可能是沒有活性的，且農藥的生產既污染環境又增加生產投入成本。香茅醇不同旋光異構體對抑制植物病原菌的活性比較及其協同效應的研究鮮有報道。本文比較了右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶炭疽病菌的毒力差異及其混用的協同效應，為茶園新型植物源殺菌劑的研發提供了理論依據。有望在今后茶樹病害生物防控中發揮重要作用，并對促進茶園減施化學農藥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及藥劑

99%右旋香茅醇購于上海阿拉丁試劑有限公司；97%左旋香茅醇[(-)--香茅醇]購于上海薩恩化學技術有限公司；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），10%多抗霉素可濕性粉劑購于山西奇星農藥有限公司，吐溫-80（天津市大茂化學試劑廠）。超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；電子天平（型號：BSA224S-CW）；恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；高溫蒸汽滅菌鍋（上海沉匯儀器有限公司）。

供試菌株：茶炭疽病菌（），由貴州省茶葉研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 香茅醇及其異構體對茶炭疽病的室內毒力

采用生長速率法[17]。在藥劑初篩的基礎上選出5個有效濃度梯度，配置成相應的PDA毒體培養基，用5?mm打孔器在活化好的茶炭疽病培養皿沿菌絲邊緣打孔，將菌餅放入到培養皿中央，帶菌絲面與PDA培養基面相接觸，以含0.1%吐溫-80和5%無水乙醇無菌水溶液作對照，每個處理4次重復。茶炭疽病菌株由貴州省茶葉研究所提供（已純化）；將密封保存在試管內的菌株用接種針挑取少量菌絲轉移到PDA培養基中，置于25℃恒溫培養箱內培養120?h，活化菌株，即可開展下一步試驗。置于25℃恒溫培養箱內培養120?h，采用十字交叉法測得菌絲體生長直徑，計算對炭疽病病菌生長的抑制率，求出毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。生長抑制率公式：

生長抑制率=(?D1－?D2)/?D1×100%

?D1為對照菌落直徑與菌餅直徑的差值，?D2為處理菌落直徑與菌餅直徑的差值。

1.2.2 香茅醇異構體不同組分增效配比篩選

根據Horsfall方法[18]設計混配比例。以右旋香茅醇和左旋香茅醇兩種單劑的有效中濃度EC50為基礎，配制兩種單劑化合物的有效中濃度藥液，按體積比(9︰1)、(8︰2)、(7︰3)、(6︰4)、(5︰5)、(4︰6)、(3︰7)、(2︰8)、(1︰9)進行混合，分別測定每組混合處理120?h后對茶炭疽病菌菌絲生長抑制率。根據體積比測度的抑制率選出較好的體積比，先配制單劑濃度梯度，再按相對應的濃度梯度順序將兩單劑按具有增效作用組合的體積比混配，得到增效配比混劑的濃度梯度。計算出各單劑和混劑處理后120?h的毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

1.2.3 數據統計方法

根據Sun等[19]的方法求出共毒系數及增效倍數，共毒系數大于120表示具增效作用，小于80表示拮抗作用，介于80~120之間表示相加作用。以劑量對數值（）為自變量，抑制率（）為因變量，采用DPS 7.05軟件計算毒力回歸方程、抑制中濃度（EC50）、相關系數。共毒系數的計算方法參照李建明等[20]的方法：

2 結果與分析

2.1 香茅醇和香茅醇異構體的室內毒力

采用菌絲生長速率法，測試了香茅醇及其不同異構體（右旋、左旋香茅醇）和10%多抗霉素（對照藥劑）對茶炭疽病菌的室內毒力（表1）。結果表明，經過處理后的120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇對茶炭疽病菌的菌絲生長抑制中濃度EC50分別為(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1，均低于香茅醇[(144.12±0.42)?mg·L-1]，而高于對照藥劑10%多抗霉素可濕性粉劑[(105.06±0.32)?mg·L-1]。

2.2 香茅醇異構體組合對茶炭疽病菌菌絲抑制作用

根據單劑毒力測定結果，對右旋香茅醇和左旋香茅醇進行混配增效配比的定性篩選。結果表明（表2），處理后120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇的EC50體積配比為(6︰4)、(5︰5)、(4︰6)、(3︰7)和(2︰8)時，對菌絲生長的校正毒力比均大于1，表現為增效作用；配比為1︰9時，校正毒力比明顯小于1，表現出拮抗作用；其他配比的校正毒力比為1左右，表現出相加作用。

根據表2結果，采用共毒系數法，對右旋香茅醇和左旋香茅醇進行混配增效配比的定量篩選。由表3可見，處理后120?h，右旋香茅醇和左旋香茅醇的五組質量比中，配比為(1∶1.4)、(1︰3.8)、(1.6︰1)時，EC50值分別為(98.05±9.02)?mg·L-1、(95.72±9.40)?mg·L-1和(89.54±8.21)?mg·L-1，共毒系數分別為120.57、121.42和130.19，均大于120，表現為增效作用，分別增效20.57%、21.42%和30.19%；另外兩個配比的共毒系數均介于111~120之間，表現為相加作用。通過兩異構體不同質量配比后能有效提升對茶炭疽病的毒力，EC50值除配比為1∶1配比外均低于對照藥劑（10%多抗霉素可濕性粉劑）。

3 討論

香茅醇及其異構體（右旋香茅醇和左旋香茅醇）對茶炭疽病（）有著較好的抑菌效果，EC50值均在150?mg·L-1以下，與Nidiry等[21]的研究結果基本一致。香茅醇屬于單萜類化合物，Knobloch等[22]報道精油成分在水中的溶解度直接關系到它們穿透細菌或真菌細胞壁的能力，決定抑菌活性的大小，根據這個理論，在今后實際加工使用中，可將其加工成水性化劑型，如微乳劑、水乳劑等，以提高親水性和抑菌活性。

表1右旋香茅醇和左旋香茅醇處理后120?h對茶炭疽病菌的毒力

Table 1 Toxicity of dextran citronellol and rhodinol against C. gloeosporioides after 120?h

表2 右旋香茅醇和左旋香茅醇EC50液混劑處理后120?h對茶炭疽病菌的毒力

注：A為右旋香茅醇，B為左旋香茅醇

Note: A: Dextral Citronellol, B: Rhodinol

注：A：右旋香茅醇；B：左旋香茅醇；P：10%多抗霉素可濕性粉劑。**，＜0.01

Note: A: Dextral Citronellol. B: Rhodinol. P: 10% Polyamphenicol WP. **,＜0.01

茶炭疽記錄和報道的病原菌有和[23]。本試驗選用進行室內毒力測定，結果表明香茅醇、右旋和左旋香茅醇對茶炭疽病菌（）的EC50分別為(144.12±0.42)?mg·L-1、(113.27±0.95)?mg·L-1和(119.87±0.20)?mg·L-1，香茅醛還具有抑蟲作用[12]，因此有望開發出兼具抑菌殺蟲作用的茶園新型植物源農藥。

目前已知的商品化的農藥中有近170余種屬于手性農藥，包括生物農藥、天然產物制劑和化學合成農藥，除了單一純手性異構體的商品外，還有一些手性農藥是含高活性手性體的消旋體商品[24]。不同的旋光異構體對藥物生物活性有著很大的影響。李琳等[25]比較了松油烯-4-醇光學異構體對家蠅的熏蒸活性差異，結果表明松油烯-4-醇的光學異構體對家蠅的殺蟲活性存在差異，外消旋體的活性明顯高于異構體單體。本試驗結果右旋和左旋香茅醇兩次測定的EC50值分別為(113.27±0.95)?mg·L-1、(119.87±0.20)?mg·L-1和(118.87±11.57)?mg·L-1、(115.54±11.78)?mg·L-1，無明顯差異，表明香茅醇旋光異構體之間無活性差異，其作用機理和作用方式的還有待進一步研究。

利用植物源農藥和微生物農藥或化學農藥復配能增強對病原菌的抑菌活性，達到增效作用[26]，但鮮見利用不同異構體混配的抑菌活性研究。通過Horsfall方法[18]和共毒系數法研究表明，右旋香茅醇和左旋香茅醇的EC50質量配比為(1︰1.4)、(1.6︰1)和(1︰3.8)時，共毒系數分別為120.57、130.19和121.42，均表現出增效作用。在本試驗中香茅醇兩個異構體都具有較高的生物活性，在增效配比下活性更高。基于此，可按本研究明確的增效配比，將香茅醇研制成植物源農藥。針對目前茶園減施化學農藥戰略，下一步將進行復配藥劑加工和田間使用技術研究。科學合理地利用天然植物源農藥進行茶園病蟲害防治，對我國茶葉的綠色健康發展具有重要意義。

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Fungicidal Activity Comparison and Synergetic Effectof Citronellol Optical Isomers Against

XIANG Xiaolong1, YANG Wen2*, LIU Huifang2, CHEN Yao2, ZHOU Yufeng2, HU Anlong1*

1. Agricultural college of Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Guizhou Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, China

In this study, the activities of dextral citronellol, rhodinol and their synergistic effect to thewas determined by method of mycelial growth rate, Horsfall and co-toxicity coefficient. The EC50of dextral citronellol and rhodinol were (113.27±0.95)?mg·L-1and (119.87±0.20)?mg·L-1respectively. The dextral citronellol and rhodinol were mixed according to the mass ratio. The result shows that the synergistic effect was the highest with the co-toxicity coefficient of 130.19 under the mass ratio of 1.6︰1 (dextral citronellol︰rhodinol). The co-toxicity coefficients were 120.57 and 121.42 when the mass ratio were 1︰1.4 and 1︰3.8, respectively. The results indicate that citronellol and its two optical isomers had high inhibiting activities against, and the synergistic effect could be performed by mixing them within certain proportion.

botanical fungicide, citronellol,

S435.711；S482

A

1000-369X(2019)04-425-06

2019-01-02

2019-02-11

國家重點研發計劃項目子項目[2016YFD0200900]、貴州省科技計劃項目[黔科合平臺人才(2017)5717]、貴州省農業科技支撐項目（黔科合支撐[2016]550號）、黔農科院青年基金[2017]14號、黔科合支撐[2018]2251

向曉龍，男，碩士研究生，主要從事農產品質量安全和茶樹病蟲害研究方面的研究。*通信作者：alhu@gzu.edu.cn