自發性2型糖尿病模型db/db小鼠生物學特性研究?

王松月，依香叫，李金誠，白穎慧，周 虹，李金波，裴凌鵬Δ

(1. 民族醫藥教育部重點實驗室，中央民族大學藥學院，北京 100081； 2. 悉尼大學NAZAC研究所， 澳大利亞； 3. 紐約州羅切斯特大學病理與藥物系，美國)

db/db小鼠是美國Jackson實驗室發現的位于 4 號染色體的Leptin 受體基因缺陷導致的自發性 2 型糖尿病小鼠。前期研究表明[1-5]，本品系小鼠于出生4周后就會出現肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等一系列糖尿病的癥狀，其生理性與行為性特征與人類2型糖尿病表現極為相似，目前被認為是較理想的2型糖尿病(T2DM)研究用動物模型。中醫學認為，糖尿病屬于“消渴”范疇，本病的基本病機為“本虛標實”，主要病位在腎，其次在肺胃等臟腑，肺脾腎氣虛是其發病基礎，瘀血、水濕、痰濁則為其主要外邪。目前，糖尿病已成為全球范圍內的一種重大疑難性疾病，具有高發病率與并發癥高致殘率、死亡率等特點。糖尿病關鍵統計指南預測，截止2035年全球T2DM患病人數可能達到5.92億[6]，而糖脂代謝失調將造成腎臟組織形態病變與功能性紊亂，最終引發慢性腎病，從而促使機體內分泌代謝、激素代謝以及鈣吸收等一系列的問題，成為誘發繼發性骨質疏松癥發生的最主要因素[7]。為此，本實驗旨在針對db/db小鼠生存周期過程的動態觀測，研究糖代謝紊亂-腎病-骨質疏松癥之間的關系，進一步驗證中醫“腎主骨”理論的科學性，并為此品系小鼠作為2型糖尿病骨質疏松癥模型的可能提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級7周齡雄性自發性2型糖尿病BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/Nju品系的db/db小鼠70只，體質量(27.03±1.60)g；基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠40只，體質量為(15.40±2.34)g，均購自南京大學-南京生物醫藥研究院[SCXK(蘇)2015-0001 ]。并全部在中國中醫科學研究院清潔級實驗室[SYXK(京)2016-0021 ]進行飼養及實驗。

1.2 實驗分組

按照體質量隨機分組，模型組(db/db雄性小鼠)和對照組(db/m雄性小鼠)各9組(依據動態觀測9個不同時間點，即7、8、9、10、11、12、16、20、24周)，模型組每組包含基因型(Leprdb)mut/mut的db/db小鼠7只，對照組每組包含基因型(Leprdb)wt/wt的db/m小鼠4只，飼養期間給予充足的純凈水，自由攝食，室溫在20～25 ℃之間，明暗交替照射12 h/12 h。

1.3 主要儀器及試劑

Life Scan Europe 生產的Ultra血糖儀及其配套血糖試紙；全自動生化分析儀(日立7020)；電子顯微鏡(日本 Olympus公司)；脫水機(武漢俊杰電子有限公司)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；組織切片機(浙江金華市科迪儀器設備有限公司)；載玻片及蓋玻片(江蘇世泰器材有限公司)；正丁醇、無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)；HE染液套裝(武漢谷歌生物科技有限公司)；CREA試劑盒、ALP試劑盒(中生北控公司，批號160601與批號160821)；BUN試劑盒(maccura公司，批號0517021)。

1.4 實驗方法

1.4.1 db/db和db/m小鼠的血糖測量 分別于第7、8、9、10、11、12、16、20、24周測定該周齡模型組與對照組的空腹血糖，檢測前將小鼠禁食8 h，經尾靜脈取血，用血糖儀測定小鼠的血糖值。

1.4.2 db/db和db/m小鼠的體質量測量及樣本采集 分別于第7、8、9、10、12、16、20、24周，測定模型組與對照組的體質量；眼球取血法收集血液200 μL，6000 r·h-1，離心15 min后分離血清，于-20 ℃冷凍儲存，后續按照試劑盒提供的實驗方法，分別檢測血清ALP、BUN、CREA的含量。而后進行處死，收集腦、心、肺、肝、腎、睪周脂肪并稱重，計算臟腦系數(即臟器(或脂肪)質量/腦質量)。

1.4.3 腎臟、脛骨不同組織病理學觀察 將不同時間點的模型組與對照組腎臟、脛骨放置于4%多聚甲醛中固定24 h，再次經過梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 空腹血糖水平

表1顯示，與對照組比較，第7周模型組的所有空腹血糖值升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；從第8周開始模型組空腹血糖值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 血糖值水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05

2.2 體質量變化

圖1表2顯示，從第7周到第24周，db/db小鼠體質量明顯高于db/m小鼠而且增長迅速(P<0.01)，而db/m小鼠體質量比較穩定并未隨著周齡增長而明顯增高。

表2 體質量水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲▲P<0.01

2.3 臟腦系數測定

表3顯示，前期研究表明[8]，絕對器官質量可能存在個體間的變異性，而臟腦系數則可以減少這些可變性，更準確地反映機體真實狀況。本實驗結果表明，與對照組比較，第7周開始模型組的心腦系數、肝腦系數、肺腦系數、睪周脂肪腦系數、腎腦系數均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 db/db與db/m小鼠的臟腦系數比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.4 生化指標測定

表4顯示，與對照組比較，第8周開始模型組血清CREA、BUN水平有所升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。第12周開始上述水平又明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。而血清ALP水平則呈現先降低后升高的趨勢，在第16周開始其水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 血清ALP、BUN和CREA水平比較

注：與db/m小鼠比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

注：圖左下為db/m小鼠，圖右上為db/db小鼠圖1 24周齡db/db小鼠與db/m小鼠體型比較

2.5 組織病理學變化

圖2 8周齡db/db小鼠與db/m小鼠腎組織病理變化

2.5.1 腎組織病理觀察 圖2顯示，8周齡的db/m小鼠腎小球形態完整，無細胞核變異，腎小管上皮形態結構正常；比較之下，db/db小鼠腎組織切片可見，腎小球基底膜均質性增厚，腎小球系膜基質增多，腎小囊基底膜增厚。

2.5.2 骨組織病理觀察 圖3顯示，24周齡db/m小鼠骨小梁粗壯，排列整齊，骨小梁密度、面積正常；比較db/db小鼠骨組織切片可見，部分骨小梁變細，形態結構不完整，空骨窩增加，骨密度和面積減少。

圖3 24周齡db/db小鼠與db/m小鼠脛骨病理變化

3 討論

前期研究表明[9]，db/m小鼠與db/db小鼠母系相同，且db/m小鼠的體質量、血糖一直處于相對正常的水平。因此本次實驗選取db/m小鼠作為對照組，可以更好地觀察db/db小鼠在不同生長周齡的體質量、血糖等變化情況。

本實驗通過對db/db小鼠7～24周的連續動態監測，發現在第8周開始db/db小鼠的空腹血糖值明顯升高，至第10周后后續一直保持在高血糖水平，表明10周齡后本品系小鼠已達到2型糖尿病血糖值標準。同時，db/db小鼠的體質量一直呈現持續增長狀態，各臟器組織/腦系數明顯高于db/m小鼠(P<0.01)，表明db/db小鼠符合自發肥胖的特征。上述結果與相關研究報道及實驗動物提供方的實驗動物模型說明基本一致[10-12]。

隨著db/db小鼠機體糖脂代謝失控，引發其腎臟組織形態學病變，導致功能性紊亂。前期研究表明[13-14]，腎臟排泄功能損害時尿素將在血中滯留，而導致血清BUN、CREA水平增加。本實驗結果也表明，在空腹血糖持續升高過程中，自第7周開始db/db小鼠血清BUN、CREA水平有所升高，并在第12周開始與對照組差異顯著，說明db/db小鼠可能出現了嚴重的腎臟排泄功能損傷。相比之下，血清ALP的變化則呈現“先降低后升高”的趨勢。究其原因可能是由于高血糖而引起滲透性利尿，導致鎂離子的丟失，同時尿糖增加又會讓鎂離子在腎小管的重吸收受到抑制，進而加重血漿鎂離子減少。而鎂離子作為ALP的激活劑，其含量的降低則會引起血清ALP的降低[15]，故在糖尿病前期血漿中的ALP先呈現降低趨勢；隨著糖尿病病情發展，其引發的脂類代謝障礙，造成肝臟受損，加之骨吸收程度增強，其變化逐漸呈現急速升高趨勢，實驗結果表明，血清ALP自第16周開始與對照組比較出現明顯升高，差異顯著(P<0.05)。與此同時，隨著骨形成-骨吸收失衡加劇，結合不同時間脛骨骨組織病理觀察，發現第24周開始出現骨小梁變細、形態結構不完整、間隙增大等現象和病理學變化。

綜上所述，db/db小鼠先在第8周出現腎臟組織形態病變與輕度功能性失調，至第12周出現腎臟功能嚴重損傷，而后在第16周出現骨代謝紊亂，第24周出現骨小梁結構的改變，誘發骨質疏松癥的發生。再次驗證了腎中精氣虛少，骨髓化源不足，骨不能得到髓的滋養，從而引起骨髓空虛，導致骨質疏松癥的中醫論斷。故此，利用db/db小鼠作為進一步探索2型糖尿病腎與骨之間的關系以及糖尿病骨質疏松癥的可行性模型提供了很好的依據。