一起霍亂疫情分離株的耐藥性和分子流行病學分析

王云霞 嚴寒秋 劉海波 史文鳳 周海健 王斌

2017年7月，北京市房山區疾控中心接到轄區某醫院疑似霍亂病例的報告，通過流行病學調查和實驗室檢測，最終確定其病原菌是O1群小川型霍亂弧菌，CT(cholera toxin)毒素陰性，溯源表明疫情與廚師有關?，F分析該起霍亂疫情分離株的耐藥性和分子流行病學特征，為霍亂疫情防控提供可借鑒的經驗。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源：樣本來自疫情中采集的患者便標本1件、密切接觸者肛拭子37件(家屬3件,其他密接34件)、患者就餐地廚師肛拭子4件、患者就餐地后廚外環境和食物原料等各種涂抹67件，共109件樣本，均放置pH=8.8堿性蛋白胨水增菌液中，常溫保存，立即送檢。

1.1.2試劑：堿性蛋白胨水和慶大霉素平板購自友康恒業生物科技(北京)有限公司，霍亂弧菌血清購自泰國S&A REAGENTS LAB公司和鄭州萬泰生物科技有限公司，霍亂弧菌O1/O139群和霍亂弧菌 CTX基因核酸檢測試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限公司；革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板購自上海星佰生物技術有限公司；限制性內切酶NotI、SfiⅠ購自美國NEB公司。上述試劑均在有效期內使用。

1.1.3儀器：瑞士Roche LightCycler 480實時熒光定量PCR儀；美國Bio-rad CHEF Mapper system脈沖場凝膠電泳儀；美國Bio-rad Gel Doc 2000凝膠成像系統；上海星佰生物技術有限公司微生物鑒定藥敏分析系統。

1.2方法

1.2.1病原菌常規分離培養: 按《霍亂防治手冊》(第6版)和《霍亂診斷標準》(WS 289-2008)對109件樣本進行增菌、分離培養、玻片凝集實驗和生化鑒定[1-2]。

1.2.2霍亂弧菌實時熒光PCR法: (1)實時熒光PCR檢測霍亂弧菌O1/O139群特異性基因：取37 ℃培養6 h的堿性蛋白胨水增菌液2 mL，于無菌2 mL離心管中，共109件樣本。用德國Minispin plus 12 000 r/min離心3 min，棄上清留沉淀。在該離心管中加入1 mL DEPC水，使管中沉淀懸浮均勻，再次同上離心棄上清留沉淀。在該離心管中加入130 μL DEPC水，使沉淀懸浮均勻后100 ℃加熱10 min，12 000 r/ min 離心10 min，取上清100 μL為基因組DNA，-20 ℃保存備用。使用霍亂弧菌O1/O139群核酸檢測試劑盒，進行實時熒光PCR法檢測霍亂弧菌O1/O139群特異性基因，操作按試劑盒說明書進行。熒光曲線Ct值≤35 且曲線呈“S”形判為陽性，提示樣本中含有O1或O139群霍亂弧菌；否則陰性,提示樣本中不含有O1或O139群霍亂弧菌。(2)實時熒光PCR檢測霍亂弧菌CTX基因：常規分離培養陽性的菌株接種LB瓊脂，37 ℃培養過夜，挑取LB平板上的單菌落于130 μL DEPC水中，采用上述水煮法提取基因組DNA。使用霍亂弧菌CTX基因核酸檢測試劑盒,進行實時熒光PCR法檢測霍亂弧菌CTX基因，操作按試劑盒說明書進行。熒光曲線Ct值≤35且曲線呈“S”形判為陽性，提示樣本為產毒株；否則陰性，提示樣本為非產毒株。

1.2.3藥物敏感試驗: 采用96孔微量肉湯稀釋法進行藥物敏感試驗，試驗藥物共20種：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、四環素、氯霉素、復方新諾明、頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、阿奇霉素、環丙沙星、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿米卡星、頭孢吡肟、美羅培南、左氧氟沙星、多西環素(強力霉素)和鏈霉素。藥敏板上倍比稀釋濃度單位為μg/mL，挑取LB平板37 ℃培養18 h的純菌，置于2 mL滅菌生理鹽水中，配(0.52±0.2)麥氏單位的菌懸液(濃度約1.5×108cfu/mL)，藥敏板35 ℃培養19 h，結果判斷等其余操作均按上海星佰生物技術有限公司微生物鑒定藥敏分析系統操作說明書進行。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗及聚類分析: 參照國家致病菌識別網和Pulse Net China監測網絡中霍亂弧菌PFGE標準方法進行PFGE[3]。菌懸液濃度為4.2～4.4麥氏單位，54 ℃水浴細菌裂解1 h，DNA用內切酶NotI和SfiI酶切4.5 h,酶切溫度分別為37 ℃和50 ℃。脈沖場凝膠電泳條件：2～10 s，13 h； 20～25 s，6 h。電泳前加硫脲(終濃度為38 μL/100 mL)，電泳后染色0.5 h，普通水脫色1.5 h，用凝膠成像系統照相，把膠塊放在調準網格線內，使膠塊的加樣孔和調準網格線的最上面一條藍線對齊,獲取合格的圖像。分子量標準為沙門菌H9812。用BioNumerics(Version 5.01)軟件對圖像進行處理,用UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法構建聚類樹。

2 結果

2.1霍亂弧菌O1/O139群特異性基因結果 109件樣本增菌液,使用實時熒光PCR法檢測O1/O139群霍亂弧菌特異性基因，O1群霍亂弧菌特異性基因陽性21件，其中患者便標本陽性1件，密接中家屬肛拭子陽性1件,患者就餐地廚師肛拭子陽性1件,患者就餐地后廚外環境各種涂抹陽性18件，陽性率19.27%；109件樣本增菌液O139群霍亂弧菌特異性基因均為陰性。初步可判斷該疫情為O1群霍亂弧菌引起。

2.2常規分離培養結果 109件樣本進行常規培養及鑒定,檢出6株O1群小川型霍亂弧菌(均從熒光PCR法陽性樣本中分離，另外15件熒光PCR法陽性樣本中未檢出霍亂弧菌),其中患者便標本檢出1株，患者就餐地廚師肛拭子檢出1株，患者就餐地后廚外環境各種涂抹檢出4株，陽性率5.50%；109件樣本均未檢出O139群霍亂弧菌。

2.3實時熒光PCR檢測霍亂弧菌CTX基因結果 6株O1群小川型霍亂弧菌,使用實時熒光PCR法檢測霍亂弧菌 CTX基因。6株菌均為霍亂CTX基因陰性，為非產毒株。

2.4藥物敏感試驗結果 對6株O1群小川型非產毒株霍亂弧菌進行了20種抗生素藥敏試驗，四環素、氯霉素、復方新諾明、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、阿奇霉素、環丙沙星、阿米卡星、美羅培南、左氧氟沙星和多西環素(強力霉素)共12種抗生素100%敏感，頭孢唑林(為頭孢一代)100%耐藥,頭孢噻肟和頭孢他啶(為頭孢三代)和頭孢吡肟(為頭孢四代)出現了部分耐藥(表1)。

表1 6株O1群霍亂弧菌對20種抗生素的藥敏試驗結果(株)

2.5PFGE分子分型結果 對6株O1群小川型非產毒株霍亂弧菌(2017HL002-007)用NotI和SfiⅠ 酶切，進行PFGE分子分型，圖譜用BioNumerics軟件分析，并通過與Pulse Net China霍亂弧菌PFGE分型數據庫進行比對，NotI和SfiI酶切的電泳圖譜均為唯一帶型，分別命名為KZGN11O1.CN1217 和KZGS12O1.CN0548。此次疫情分離的6株菌呈現的條帶相似度系數為100.0%，與2017年北京市分離的其余3株O1群霍亂弧菌相似度系數為70.0%(條帶數差異大于10條,圖1)。

注：菌株BJ2017HL002-BJ2017J007是本次疫情分離菌株；BJ2017HL001、BJ2017HL008、BJ2017HL009是北京市2017年其他霍亂疫情分離菌株。圖1 NotI和SfiⅠ酶切6株菌在北京市2017年霍亂弧菌PFGE數據庫中的分型結果

3 討論

3.1霍亂弧菌中O1/O139血清群霍亂弧菌可引起急性腸道傳染病，CT為霍亂弧菌主要毒力因子，是目前已知致瀉毒素中最強烈的一種[1]。2007-2014年，北京市霍亂弧菌日常監測中檢出的125株O1群霍亂弧菌以小川型非產毒株為主導[4]，國內其他省市也有非產毒株引起腹瀉疫情報道[5]，此次疫情也是非產毒株引起。因此，在霍亂弧菌常規監測中應提高對非產毒株的重視。

3.2霍亂弧菌疫情報告有著極高的敏感性，傳統培養法耗時長、工作量大、靈敏度低，且容易造成漏檢。目前,更加快捷的分子生物學技術已廣泛應用于病原微生物檢測中[6-8]，LYON[9]利用Real-time PCR 探針法檢測霍亂弧菌hlyA基因，僅用3 h，且最低檢測靈敏度達到了 8 cfu/g(糞便樣)、10 cfu/mL(水樣)。本次疫情先采用熒光定量PCR法檢測109件樣本增菌液,共有21件樣本O1群霍亂弧菌特異性基因陽性，得以快速鎖定目標病原菌為O1群霍亂弧菌。在后期分離培養中，109件樣本檢出6株O1群小川型霍亂弧菌，均從熒光PCR法陽性樣本中分離得到，另外15件PCR法陽性的樣本及88件PCR法陰性的樣本，均未檢出霍亂弧菌。由此可見，熒光定量PCR法和經典的分離培養法有機結合，能快速確定病原菌，這與有關報道是一致的[10]。

3.3對6株霍亂弧菌進行抗菌藥物敏感性分析,結果顯示這6株霍亂弧菌對20種藥物中的12種100%敏感，對頭孢唑林(為頭孢一代)100%耐藥,可作為對此次疫情相關病例及帶菌者進行藥物治療的依據；另外，6株霍亂弧菌對頭孢噻肟和頭孢他啶(為頭孢三代)及頭孢吡肟(為頭孢四代)出現部分耐藥，二代頭孢霉素頭孢西丁其母核與頭孢菌素相似，抗菌活性與頭孢二代相似，但是試驗結果100%敏感。所以下一步應對這6株菌耐藥基因和耐藥整合子是否有差異進行深入研究[11]，從分子水平闡明其耐藥特性。

3.4PFGE是致病菌引起的疫情溯源的“金標準”,有報道對NotⅠ和SfiⅠ進行了深入的比較研究，認為同時使用兩種酶更能從多角度準確的研究菌株間相關性[12]。此次疫情流調報告為O1群小川型霍亂弧菌陽性的廚師未出現腹瀉癥狀，呈健康狀態。此次疫情，后廚的水池、加工臺面、洗魚池及餐盤涂抹標本分離的4株菌同患者和廚師分離的2株菌，應用了NotⅠ和SfiⅠ兩種酶進行酶切，依據PFGE圖譜結果，其相似度系數為100.0%，具有一致性，即高度同源，與2017年北京市數據庫中的其他菌株相似度系數為70.0%，親緣關系相差較遠。所以推測健康帶菌廚師為此次疫情的傳染源，在工作中污染了后廚的環境，最終感染了患者。因此，在霍亂流行季節，應強化日常監測，特別是加強餐飲從業人員健康體檢，有效切斷健康帶菌者這一傳染源，同時普及食品安全教育，從多方位預防霍亂疫情的發生。