小麥microRNA167e的特征及表達模式分析

常亞南，王瀑童，吳玉杰，袁曉波，樊亞棟， 張 莉，王苗苗，李夢園，孟凡榮，李永春

(1.河南農業大學農學院，河南鄭州 454002; 2.河南農業大學生命科學學院，河南鄭州 454002)

MicroRNA(miRNA)是一類在植物中廣泛存在的小RNA(21～24nt)，在植物生長發育調控和逆境脅迫響應過程中發揮重要調控功能[1-2]。近年來，隨著高通量測序技術的迅速發展，大量的植物miRNA被鑒定。目前，在miRNA數據庫(miRBase)中已包含了82種植物的miRNA信息，其中來源于擬南芥、水稻、玉米和小麥的miRNA分別有428、738、325和125條。在擬南芥中，一些miRNA參與了碳氮代謝的調控過程[3]；在水稻[4]和玉米[5]中，一些miRNA參與了干旱、高鹽、淹水等逆境脅迫的響應過程；最近的研究顯示，小麥根系中依賴于miRNA的調控途徑參與了谷胱甘肽相關的氧化還原調控過程[6]。在大量被鑒定的植物miRNA中，miR167是一類植物中普遍存在的保守型miRNA，在植物發育過程中發揮重要的調控功能。比如，miR167與擬南芥的胚和根系發育調控密切相關[7-8]，在番茄中該miRNA過表達后導致了花發育異常和雌性不育[9]，在水稻中miR167具有不同的時空表達模式[10-11]，且對植物外源生長素具有特定的響應模式[12]。目前，有關小麥miR167的研究還未見報道。我們前期發現，miR167與小麥籽粒的發育調控密切相關[13]。本研究擬系統分析小麥中該miRNA的染色體定位、序列特征、時空表達特性及其對滲透脅迫的響應，為明確miR167在小麥發育調控及逆境脅迫響應過程中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

小麥(TriticumaestivumL.)材料包括豫麥18、矮抗58和中國春3個品種，于河南農業大學農業實驗基地種植。在開花期掛牌，依次剪取授粉后5、10、15、20、25、30 d的麥穗，剝取籽粒。幼苗室內培養：選取籽粒飽滿小麥種子經HgCl2表面消毒7 min后用無菌水沖洗；在培養皿中培養，氣候箱光照強度為240 mol·m-2·s-1，光照時間為14 h，溫度為24 ℃(光照)和18 ℃(黑暗)。滲透脅迫處理方法為：將培養至二葉一心期的幼苗，用20%的PEG6000溶液進行模擬干旱脅迫處理；用150 mmol·L-1的NaCl溶液進行模擬鹽脅迫處理；在脅迫處理0、0.5、1、2、6、12、24、 48 h分別剪取根系和葉片組織備用。用于進行不同組織表達特性分析的材料包括：田間種植條件下成熟籽粒，開花期的穗下節、旗葉、節間、節，以及室內培養的三葉一心期的根系和葉片組織。上述試驗均設三個生物學重復，所有組織取樣后均需迅速液氮速凍，然后于-80 ℃保存備用。

1.2 基因染色體定位和生物信息學分析

采用來源于小麥的miR167e序列進行小麥基因組數據庫EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)比對分析，對MIR167基因進行定位并注釋。利用NCBI轉錄組的數據庫搜索TaMIR167e基因的轉錄序列。運用RNAfold軟件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form)對pre-miR167序列的發卡結構進行預測；運用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對MIR167e基因的啟動子元件進行預測。運用PASPA(http://bmi.xmu.edu.cn/paspa/interface/run_PASPA.php)對MIR167e基因的下游調控序列進行預測。采用primer 5.0軟件進行引物設計，克隆TaMIR167e的上游引物為YP1669(5′-GCCCCCAATTATTCCCACCTCT-3′)，下游引物為YP1667(5′-AGTAACACCCAAGAAACCC AGATCC-3′)，基因組A特異性鑒定上游引物YP1673(5′-CTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCA-3′)，基因組B特異性鑒定上游引物YP1670(5′-GACCTCCTTCCCCGCCC-3′)，與通用下游引物YP1667組合進行基因組A、B的鑒定。tae-miR167e的表達分析引物為YP0943(5′-TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA-3′)，下游引物為全式金試劑盒提供的通用引物。定量分析采用U6為內標,引物序列為：YP1303(5′-CCTTCGGGGACATCCGATAAA-3′)和YP1304(5′-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′)。

1.3 RNA提取和cDNA的克隆

總RNA的提取采用Trizol法，具體的提取步驟參照TaKaRa的RNAiso Plus的說明書進行。并通過非變形瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測總RNA的完整性、質量、純度和濃度。用于tae-miR167e基因克隆的cDNA采用試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，用于tae-miR167e表達特性分析的cDNA采用試劑盒(TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Supermix)。合成的cDNA于 -80 ℃保存備用。以上述cDNA為模板，克隆片段經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后、DNA片段凝膠回收、純化、連接到pMD19-T載體。利用基因組A、B特異性引物，篩選出基因組A、B和D(A、B以外的重組克隆)的單克隆，送公司測序。

1.4 表達特性分析

采用Bio-Rad CFXConnectTM熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR。反應體系為20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物 (10 μM)各0.4 μL，用RNase-free water補足到20 μL。每個反應3次重復。采用兩步法PCR，94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環。熒光定量結果用2-△△Ct法計算，用Excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 小麥 MIR167e基因的鑒定和序列分析

課題組前期研究中發現，tae-miR167的一個家族成員(5′- TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA -3′)在小麥籽粒發育過程中逐漸上調表達；通過與miRBase數據庫序列比對發現，該miRNA為小麥miR167家族新成員，將其命名為tae-miR167e(圖1A)。利用該miRNA序列進行小麥基因組Ensembl Plants比對分析顯示，ta-miR167e基因位于第5同源群染色體的短臂，將其在A、B和D基因組的3個部分同源基因分別命名為ta-miR167e-5AS、ta-miR167e-5BS和ta-miR167e-5DS；通過與NCBI轉錄組的序列比對、轉錄起始位點和加尾信號的預測分析，將ta-miR167e的3個部分同源基因進行了注釋(圖1B)。序列比對顯示，3個部分同源基因在上游調控區域差異較大，與5AS位點相比，5BS和5DS在上游調控區域的序列一致性分別為88%和86%。通過PlantCARE軟件對該基因上游 2 000 bp啟動子區域分析發現，上游調控區包含有光響應相關元件(GATA-motif和G-box)、生長素響應元件(TGA-element)、分生組織特異調控元件(CCGTCC-box和CAT-box)、Myb結合位點(MBS和MRE)、種子特異調控相關順式作用元件RY-element和脫落酸響應原件ABRE等多個調控元件。為進一步證實ta-miR167e前體的序列特征，利用特異引物YP1669和YP1667從3個小麥品種(中國春、豫麥18和矮抗58)的cDNA中擴增獲得了長度約431 bp的片段(圖1C)。將該片段回收、連接到T-載體、轉化大腸桿菌，利用A、B和D基因組特異引物對重組克隆進行鑒定，然后進行測序分析。結果表明，在轉錄起始位點下游85～225 bp(豫麥18)的RNA折疊區域高度保守；但3個部分同源基因之間仍存在SNP差異(圖1D)；通過RNA折疊分析顯示，3個部分同源基因均能形成特定的發夾結構(圖1E)。對克隆區域的序列比對發現，在所檢測的3個品種間存在SNP和InDel差異，在第32和79個核苷酸位置豫麥18中分別存在2個核苷酸缺失和1個SNP差異，在第364和390位核苷酸處，矮抗58存在2個SNP差異(圖1F)。

2.2 籽粒發育過程中tae-miR167e的表達模式

利用實時定量對tae-miR167e在小麥籽粒發育過程中的表達動態分析結果(圖2)顯示，豫麥18小麥籽粒發育過程中tae-miR167e的表達量逐漸上升，授粉后第30天時表達量最高；矮抗58小麥僅在籽粒發育后期(授粉后30 d)表現出該miRNA的迅速上調表達，表達量為籽粒發育早期的10倍左右；在中國春中，從授粉后20d起tae-miR167e的表達量也明顯上調，直至籽粒發育后期仍保持較高的表達水平。總體來看，tae-miR167e在小麥籽粒發育過程中呈上調表達的趨勢，這預示著該miRNA在籽粒發育過程中發揮重要調控功能；tae-miR167e的表達動態在品種間存在明顯差異，在花后10～25 d期間，該miRNA的表達量在豫麥18籽粒中最高，其次是中國春，在矮抗58中表達水平最低；但在花后30 d時，在矮抗58中最高，這種表達差異可能與不同品種的籽粒發育特性有關。

A：小麥miR167家族成員的序列比對；tae-miR167a～d的基因來源于miRBase數據庫中的小麥；B：TaMIR167e三個部分同源基因的基因組結果；DS：下游；C：TaMIR167e基因的cDNA擴增結果；M：DL2000；1：矮抗58；2：豫麥18；3：中國春；D：Pre-miR167基因的A、B、D序列比對；黑色實線：成熟的miR167e的序列；E：Pre-miR167e的RNA折疊的發卡結構；綠色堿基：成熟miR167e序列；F:三個品種間TaMIR167e基因克隆區域序列比對分析

A:Sequence comparison of miR167s in wheat;tae-miR167a-d was derived from wheat sequences in miRBase datebase; B:Genomic results of three partial homologous genes ofTaMIR167e; DS:Downstream; C:Results of cDNA amplification ofTaMIR167egene; M:DL2000; 1-3:Fragments amplified from the cDNA of wheat variety Aikang 58,Yumai 18 and Chinese Spring,respectively; D:Comparison of A,B and D homologous of pri-miR167e genes,and the mature miR167e sequences are highlighted with black line; E:RNA folding hairpin structure of pri-miR167e and mature miR167e sequence is highlighted with green base; F:Sequence alignment of cloned regions ofTaMIR167efrom the three varieties.

圖1 小麥TaMIR167e三個部分同源基因的克隆及特征分析

Fig.1 Cloning and characterization of three homeologous genes of TaMIR167e

2.3 小麥tae-miR167e的組織表達特性

通過檢測不同組織中tae-miR167e的表達特性發現(圖3)，在3葉期，該miRNA在葉片和根系中表達量較高，在成熟種子中次之，開花期穗下節中表達量最低；在開花期旗葉、節間和節中的表達量在品種間差異較大。在開花期豫麥18旗葉中，tae-miR167e的表達量顯著低于矮抗58和中國春，而在3葉期幼葉和開花期的節間中，該miRNA的表達量顯著高于另兩個品種，且在節間中的表達量最高。不同品種間該miRNA的差異表達可能與品種間發育調控的差異有關，例如，開花期矮抗58的莖和節間中該miRNA的表達水平較低，這可能與該品種植株較矮有關。總體來看，tae-miR167e在不同品種和相同品種不同組織間存在表達差異，推測其對小麥不同組織的發育有一定的調控作用。

圖柱上的字母不同表示材料間差異顯著(P<0.05)。圖3同。

Different letters on the columns in dicate significant difference among the three materials at 0.05 level.The same in figure 3.

圖2 tae-miR167e在籽粒發育過程中的表達特性分析

Fig.2 Expression patterns of tae-miR167e in developing wheat grains

圖3 tae-miR167e的組織表達特性分析Fig.3 Expression characteristics of tae-miR167e in different tissues

2.4 小麥tae-miR167e對滲透脅迫的響應

在PEG6000溶液(20%)介導的模擬干旱脅迫條件下(圖4A和B)，tae-miR167e在矮抗58和中國春兩個品種的根系和葉片中均表現出受干旱脅迫誘導而上調表達的趨勢，不過在兩個品種間表達水平和動態均有較大差異。在矮抗58根系中(圖4A)，tae-miR167e在受脅迫0.5 h時迅速上調表達，之后表達水平回落；而在中國春根系中，該miRNA在脅迫處理0.5 h時僅有小幅的上調表達，在脅迫處理12 h時表達水平迅速升高，之后逐漸回落。整體來看，矮抗58根系中該miRNA對干旱脅迫的響應要比中國春更快，這可能與矮抗58具有較強的抗旱能力有關。在矮抗58的葉片中(圖4B)，tae-miR167e受脅迫后表達逐漸上調，脅迫處理24 h達到最高；而在中國春葉片中，該miRNA雖然也表現出一定上調表達趨勢，但整體表達水平明顯低于矮抗58，推測tae-miR167e在小麥干旱脅迫響應過程中發揮重要調控功能。在150 mmol·L-1NaCl鹽脅迫條件下，tae-miR167e在根系中的表達水平隨時間延長雖有小幅的波動，但是整體表現為受脅迫而表達下調的趨勢(圖4C)；從總體表達模式來看，tae-miR167e在鹽脅迫和干旱脅迫過程中表現出不同的響應模式，這可能與這兩種滲透脅迫過程具有不同的脅迫響應通路有關；在葉片中(圖4D)，所檢測兩個品種tae-miR167e呈現出相似的鹽脅迫誘導表達模式，即整體表現為受鹽脅迫而上調表達，且在脅迫0.5 h和6 h兩個時間點出現兩個表達峰，脅迫處理12 h后表達水平迅速回落；tae-miR167e在矮抗58小麥葉片中的表達水平明顯高于中國春，這可能與所檢測兩個品種間脅迫響應機制的差異有關。

A：20%PEG處理的根；B：20%PEG處理的葉；C：150 mmol·L-1NaCl處理的根系；D：150 mmol·L-1NaCl處理的葉片。

A:Roots treated with 20% PEG; B:Leaves treated with 20% PEG; C:Roots treated with 150 mmol·L-1NaCl; D:Leaves treated with 150 mmol·L-1NaCl.

圖4 tae-miR167e在滲透脅迫過程中的表達模式

Fig.4 Expression patterns of tae-miR167e under osmotic stresses in wheat

3 討 論

小麥是全球重要的糧食作物，提高小麥籽粒產量、改善加工品質是保障世界糧食安全和提高人民生活水平的重要研究方向[14]。小麥籽粒發育過程是決定小麥產量和品質的關鍵時期，開展小麥籽粒發育分子調控機制的研究對于小麥高產優質分子育種具有重要的意義。本課題組前期研究中，系統分析了小麥籽粒發育調控相關的miRNA，發現miR167與籽粒發育過程密切相關[13]。本研究中，進一步對小麥tae-miR167e的序列特征和表達模式進行了系統分析，結果顯示，該miRNA在所檢測的3個品種中的表達模式均與籽粒灌漿過程呈正相關趨勢，這與大麥中的研究結果一致[15]。預示著該miRNA對小麥發育發揮重要調控功能。miR167e在灌漿過程中的表達水平在品種間存在一定的差異，在矮抗58中，花后20 d后開始上調表達，花后30 d達到最高，可能與該品種具有較高的抗逆特性有關。近年來，一些研究結果表明，miR167在植物發育的多個環節中發揮重要調控功能。例如，擬南芥的miR167表達抑制導致了晚花表型[16]，該miRNA受藍光的誘導而上調表達[17]；水稻的miR167在花藥發育過程中特異上調表達，并持續到三細胞花粉階段[18]；另有研究發現，miR167通過調控其靶基因ARF6/8參與了龍眼(DimocarpuslonganLour)體細胞胚發育[19]、鴨茅(DactylisglomerataL.)階段發育[20]以及煙草的開花[21]調控過程。本研究發現，小麥的tae-miR167e在成熟種子、開花期旗葉、穗下節、節間和節、三葉期葉和根中存在時空差異表達現象，且表達模式在不同品種間存在差異。通過對該miRNA基因上游調控區域的序列進行分析發現，該基因轉錄調控區存在一些與發育調控相關的順式元件，比如分生組織特異的調控元件(CAT-box)和種子特異性調控元件(RY-element)等，這可能是影響該tae-miR167e出現時空表達差異的重要原因。

大量研究發現，miRNA在逆境脅迫響應過程中發揮重要功能。例如，miR1139參與了低磷脅迫的響應調控[22]，miR408與水稻的冷脅迫和干旱脅迫響應密切相關[23]。近期的研究也發現，miR167參與了多種逆境脅迫響應的調控，比如番茄的細菌脅迫[24]、橡膠樹的干旱脅迫[25]及玉米的滲透脅迫[26]等。本研究發現，tae-miR167e對干旱和鹽脅迫均有響應，且在根系和葉片中具有不同的響應模式，而且干旱和鹽脅迫過程中該miRNA的表達模式也存在較大差異，這可能與干旱和高鹽脅迫具有不同的信號通路有關。序列分析顯示，在tae-miR167e基因上游調控區域存在一些與脅迫響應相關的的元件，比如茉莉酸響應元件(TGACG-motif)、脫落酸響應元件(ABRE)、和光響應元件(ATCT-motif)等，這些元件可能與該miRNA參與逆境脅迫響應密切 相關。

在植物中，miRNA的序列相對較為保守，但是由于不同物種間基因組差異較大，導致編碼miRNA的基因也存在序列差異[27]。本研究發現，miR167包含多個家族成員，tae-miR167e與其他成員的編碼基因間序列存在一定差異。與Ensemble數據庫進行BLAST分析顯示，TA-MIR167A與第5染色體群的短臂基因位點100%匹配，而TA-MIR167C與第6染色群短臂的基因位點100%匹配；TA-MIR167B和TA-MIR167D在中國春基因組中未發現完全匹配的基因位點，這可能是由于不同小麥品種間的差異所致，也可能是miRNA形成過程中存在復雜的編輯現象所致，具體原因有待進一步證實。由于miRNA家族的成員間可能存在功能互補或冗余現象，從基因組水平進行miRNA基因的敲除和miRNA功能分析存在較大困難，因此直接針對成熟miRNA進行人工miRNA過表達和STTM抑制表達分析就成為理想的分析方法[28]，關于小麥tae-miR167e的生物學功能驗證分析工作仍在進 行中。