雙下肢淺表播散型汗孔角化癥一例基因突變檢測(cè)

于越乾 付希安 劉 紅 張福仁

汗孔角化癥(porokeratosis, PK)是一種少見(jiàn)的、與遺傳密切相關(guān)的慢性進(jìn)行性角化不全疾病，臨床表現(xiàn)為環(huán)形皮損，中央萎縮凹陷，周圍有堤狀或疣狀角化增生。組織病理學(xué)特征性存在角質(zhì)樣板層，即角化不全柱。除Mibelli描述的經(jīng)典斑塊型汗孔角化癥外，還可以分為淺表播散型(DSP)、播散性淺表性光線型(DSAP)、掌跖泛發(fā)型(PPPD)、疣狀斑塊型(PM)、單側(cè)線狀型、炎癥角化型、點(diǎn)狀汗孔角化癥、丘疹型、顯著角化過(guò)度型以及混合型等多種類型[1]。PK好發(fā)于四肢、面頸、軀干及掌趾部位，僅局限于下肢的汗孔角化癥少見(jiàn)。本文報(bào)道1例僅局限于雙下肢的淺表播散型汗孔角化癥，我們通過(guò)全基因外顯子發(fā)現(xiàn)其MVK基因發(fā)生剪切位點(diǎn)突變，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 患者,男，63歲。因雙下肢泛發(fā)暗褐色皮疹伴癢16個(gè)月，于2018年8月24日來(lái)我院就診。患者16個(gè)月前雙足背出現(xiàn)散發(fā)的綠豆大淡紅色丘疹，皮損逐漸向上蔓延擴(kuò)大，自覺(jué)瘙癢。在外院使用糖皮質(zhì)激素類藥物治療后皮損加重。患者既往體健，家族成員中無(wú)類似疾病患者(圖1)。皮膚科檢查：雙下肢見(jiàn)米粒大淡褐色扁平丘疹，丘疹中間部分可見(jiàn)凹陷，邊緣纖細(xì)如一圈黑線(圖2)，口腔黏膜及外陰部未見(jiàn)明顯損害。皮膚組織病理示：表皮角化過(guò)度、角化不全，在角蛋白凹陷處可見(jiàn)不全角化柱，真皮可見(jiàn)非特異性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)，結(jié)合臨床表現(xiàn)診斷為汗孔角化癥。診斷明確后，給予硅油乳膏外搽以及維甲酸軟膏封包，在取得患者的知情同意后，抽取患者外周血2 mL進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2 材料準(zhǔn)備 外周血DNA的提取：采用天根基因組DNA試劑盒(天根生化科技有限公司)提取外周血基因組DNA，將DNA樣本濃度調(diào)至30 ng/μL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)患者的外周血DNA進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。首先進(jìn)行基因組DNA建庫(kù)和目標(biāo)區(qū)域捕獲，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的樣品外顯子文庫(kù)按照標(biāo)準(zhǔn)程序在Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序，全基因組外顯子測(cè)序由艾吉泰康生物科技(北京)有限公司完成。得到的原始測(cè)序結(jié)果排除dbSNP151數(shù)據(jù)庫(kù)、1000Genome Project數(shù)據(jù)庫(kù)、HapMap Project數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的SNP位點(diǎn)，通過(guò)BWA軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并優(yōu)先與已報(bào)道的PK相關(guān)基因比對(duì)。

根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果，對(duì)篩選的位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，設(shè)計(jì)引物序列MVK-F：TTGGGCTTTATGGCCTGTTGG，MVK-R：CAGTGTCGTGGGCTCCTCT，由華大基因公司合成。PCR擴(kuò)增條件如下：Premix TaqTM6.5 μL，DNA樣本(標(biāo)化為濃度30 mg/μL)0.7 μL，正反向引物共0.5 μL，雙蒸水5 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，90℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。純化后的DNA產(chǎn)物在ABI 3130XL基因遺傳分析儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

將原始二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行dbSNP151數(shù)據(jù)庫(kù)、1000Genome Project數(shù)據(jù)庫(kù)、HapMap Project數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，結(jié)合之前報(bào)道的PK相關(guān)基因(PMVK, MVK, MVD, FDPS等),我們將DSP的致病基因鎖定為位于12號(hào)染色體的MVK基因。先證者在MVK基因10號(hào)內(nèi)含子存在一剪切位點(diǎn)突變，位于11號(hào)外顯子前兩個(gè)堿基(c.1040-2A>C)。進(jìn)一步采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)到該位點(diǎn)后進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證，而100名正常對(duì)照中未檢測(cè)到該位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果如下(圖4)。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)既往曾在1例播散性淺表性光線型汗孔角化癥(DSAP)患者中報(bào)道過(guò)。使用SIFT和Polyphen工具對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，得出數(shù)據(jù)分別為0和1，推測(cè)該剪切位點(diǎn)突變有害。

圖1先證者家系圖圖2右下肢見(jiàn)米粒大淡褐色扁平丘疹，丘疹中間部分可見(jiàn)凹陷，邊緣纖細(xì)如一圈黑線圖3表皮角化過(guò)度、角化不全，在角蛋白凹陷處可見(jiàn)不全角化柱，真皮可見(jiàn)非特異性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(HE，×100)

圖4Sanger測(cè)序驗(yàn)證引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖(正向及反向)，檢測(cè)到MVK基因發(fā)生c.1040-2A>C突變，為錯(cuò)義突變

3 討論

PK由Vittorio Mibelli在1983年首次描述并命名，流行病學(xué)研究顯示PK好發(fā)于20～40歲，發(fā)病率隨年齡增加而增加，在男女之間發(fā)病率大致相同[2]。1937年Andrew首先發(fā)現(xiàn)DSP，將其歸類為PM的一個(gè)臨床亞型[3]。DSP為常染色體顯性遺傳，多在青少年發(fā)病，癥狀隨年齡增加而更加明顯。多發(fā)于顏面、頸、軀干、掌跖及四肢暴露部位，表現(xiàn)為大小不等的圓形、環(huán)形或不規(guī)則形淡褐色斑，邊緣有一纖細(xì)黑線，中央部分凹陷，紫外線不是本型的誘發(fā)因素[1]。

PK需同光化性角化病、脂溢性角化病、扁平苔蘚、萎縮性硬化性苔蘚、疣、疣狀表皮痣、Bowen病、線型銀屑病等相鑒別[4]。臨床上偶爾可見(jiàn)PK局限于某一部位。Joshi等[2]回顧27例局限于外生殖器及肛門(mén)臀部的PK，病變最常見(jiàn)的部位是陰囊、陰莖、臀部和鄰近的大腿，這些患者往往難以確診并且各種治療效果均欠佳。本例DSP患者皮損僅局限于雙下肢，身體其他部位未見(jiàn)皮損，目前國(guó)內(nèi)共報(bào)道3例局限于雙下肢的PK。鄒睛等[5]報(bào)道1例藏族患者局限于雙下肢淺表播散性角化性丘疹2年余；柏亞萍等[6]報(bào)道1例局限于左小腿疣狀斑塊型汗孔角化癥伴劇烈瘙癢；林盡染等[7]報(bào)道急性蕁麻疹后發(fā)生的發(fā)疹性丘疹型PK1例，該患者皮損局限于雙下肢2 周且無(wú)自覺(jué)癥狀。此外，單側(cè)線狀型PK發(fā)生在單側(cè)肢體。這表明不同臨床亞型PK都可以局限于某一部位。PK臨床差異較大，同一家系中不同患者的臨床表現(xiàn)可不同。先證者皮損局限于雙下肢，這可能由于環(huán)境因素及單核苷酸多態(tài)性等影響因素造成。

PK已被證明與多個(gè)基因突變有關(guān)。2012年Luan和Cao等[8，9]在中國(guó)患者中鑒定出了幾個(gè)DSAP的易感位點(diǎn)，并定位在16q24.1-24.3和12q21.2-24.21。2015年，Zhang等134例進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3個(gè)新基因(PMVK, MVD, FDPS)發(fā)生突變[10]。有33%和16%的汗孔角化癥患者檢測(cè)到有MVK基因突變，體外功能研究提示MVK可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受紫外線照射后的誘導(dǎo)凋亡[11，12]。目前已發(fā)現(xiàn)40多個(gè)致病突變位點(diǎn)，其中65.9%是錯(cuò)義突變，大多數(shù)突變發(fā)生在外顯子10，表明它編碼一個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域[13]。

MVK基因定位于染色體12q24，由10個(gè)編碼外顯子和1個(gè)非編碼外顯子組成，編碼產(chǎn)物為甲羥戊酸激酶7[14，15]。MVK基因突變可產(chǎn)生多種臨床亞型，即使攜帶同一突變位點(diǎn)也可能出現(xiàn)不同的臨床表型, 其中常見(jiàn)的有斑塊型PK、播散性淺表型PK、播散性淺表性光化型PK，有研究者發(fā)現(xiàn)MVK基因c.604G>A突變?yōu)镈SAP與PM的共同致病突變位點(diǎn)[16]。本例患者M(jìn)VK基因發(fā)現(xiàn)剪切位點(diǎn)突變位于MVK基因第四個(gè)保守區(qū)域內(nèi)，此區(qū)域可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化及紫外線導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。Parimi等[17]曾報(bào)道攜帶此位點(diǎn)的1例DSAP患者，c.1040-2A>C可以引起DSAP及DSP兩種臨床亞型。

在本研究中我們報(bào)道了1例僅局限于雙下肢的DSP，并通過(guò)全基因組外顯子測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)一突變位點(diǎn)c.1040-2A>C，該突變位點(diǎn)可能可能與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化及紫外線導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)，為DSAP與DSP的共同突變位點(diǎn)，這為PK的遺傳致病基因?qū)W說(shuō)提供了證據(jù)，也為將來(lái)的遺傳咨詢、基因診斷奠定了基礎(chǔ)。