慢性自發性蕁麻疹患者外周血嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達

孔 偉 曹艷云 曹秀妮 徐 徉 蔡海斌 徐順明

慢性自發性蕁麻疹(chronic spontaneous urticarial, CSU)是指不論病因是否清楚，不依賴于任何外源性物理刺激，由內源性因素引起的慢性蕁麻疹[1]。嗜堿粒細胞和肥大細胞與CSU的發病機制相關，雖然嗜堿粒細胞占體內白細胞的比例不到1%，但它是IgG介導的過敏反應的主要參與者之一，且能募集促炎細胞，如嗜酸粒細胞和中性粒細胞[2]。此外，嗜堿粒細胞有多種表面標志物表達，其中CD63和CD203c是判斷嗜堿粒細胞活化和分化最有效的標志物[3,4]。

我們采用流式細胞術檢測風團持續不同時間以及治療后風團消退、病情暫時控制的CSU患者外周血中嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達水平，評估嗜堿粒細胞在風團不同狀態下的活化情況，探討外周血嗜堿粒細胞活化在CSU發病機制中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 隨機選擇本科室2017年12月至2018年12月前來就診的CSU患者。病例入選標準：(1)18～65歲；(2)風團單個皮損持續時間<24 h，反復發作6周以上，每周至少發作2次；(3)無過敏性鼻炎，哮喘，特異性皮炎等過敏性疾病病史；無寄生蟲感染及自身免疫性疾病病史；(4)符合慢性自發性蕁麻疹診斷標準。排除標準：(1)妊娠及哺乳期婦女；(2)遺傳性血管性水腫、慢性可誘導性蕁麻疹和其他類型慢性蕁麻疹；(3)過去3天內使用過抗組胺藥物，過去4周內已使用過糖皮質激素、免疫抑制劑、止血或抗凝血藥；(4)合并皮炎、濕疹等引起瘙癢的皮膚病。(5)嚴重的系統性疾病，包括心臟病、嚴重肝腎功能不全、血液系統疾病、自身免疫性疾病，慢性感染、精神病、惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、吸毒和酗酒患者等。本研究通過我院醫學倫理委員會審核批準，所有患者及健康對照均簽署知情同意書。評分標準[1]：患者入組，填寫臨床調查表，了解治療前的風團情況與風團持續時間、瘙癢癥狀、并進行量化評分。按下列兩項進行評價：評分相加即為總評分。(1)風團數目：0分為無風團；1分為風團數<20個/24 h；2分為風團數20～50個/24 h；3分為風團數>50個/24 h，或有大面積風團。(2)瘙癢程度：0分為無瘙癢；1分為輕度瘙癢；2分為中度瘙癢，但不影響日常生活和睡眠；3分為重度瘙癢，不能忍受，嚴重困擾日常生活和睡眠。治療方案選擇：選用一種或兩種新一代抗組胺藥物依巴斯汀片(10 mg，1/日，口服)和/或左西替利嗪膠囊(5 mg，1/晚，口服)，如經治療4周皮疹仍未控制者，納入剔除范圍。

1.1.2 分組方法 共選取符合研究要求的CSU患者45例。按風團持續時間與治療情況納入A、B、C三組。

A組：風團在2 h內自行消退者15例，其中男性5例，女性10例，平均年齡(38.38±11.05)歲(22～61歲)。風團未消退時采集血樣。B組：風團持續12～24 h自行消退者15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(40.64±13.09)歲(21～61歲)。風團未消退時采集血樣。C組：經治療后風團消退持續一周未復發者15例，其中男性6例，女性9例，平均年齡(32.83±13.07)歲(20～61歲)。D組：健康對照組，為門診體檢血常規、肝腎功能、血糖血脂正常，既往無過敏性及系統性疾病健康者。15例，其中男性8例，女性7例，平均年齡(40.69±11.19)歲(22～58歲)。

1.2 主要試劑與儀器 熒光標記單克隆抗體：美國BECKMAN COULTER公司Anti-HLA-DR-PC5、CD123-ECD、CD63-FITC、CD 203c-PE ，流式細胞儀為美國BECKMAN COULTER NAVIOS流式細胞分析系統。

1.3 樣本采集與測定

1.3.1 所有患者和健康對照者各抽血5 mL，靜置后4000 r/min(r=10 cm)離心5 min，留取上清，及時檢測。

1.3.2 標本處理分別向已編好號的試管中加入10 μL單克隆抗體；分別向試管中加入混勻的100 μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育20～30 min；加入溶血劑500 μL，避光15 min；上機測樣。

1.3.3 檢測及分析 每次檢測前均用Flow.Check熒光微球(Beckman Coulter)校準儀器，標本上機后，先以前向角散射光和側向角散射光參數大致觀察細胞形態，選取有核細胞，排除細胞碎片和雜質。選取CD123陽性而HLA-DR陰性的細胞即為嗜堿粒細胞，用CD63和CD203c雙參數進行分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件處理，數據資料以(均數±標準誤)表示，不同組間進行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FCM圖表現 先選取CD123+HLA-DR-的外周血嗜堿粒細胞，再選取CD63+CD203c+活化的嗜堿粒細胞，結果表明A、B、C三組較D組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+的熒光強度增加，陽性率增高。見圖1。

2.2 四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達情況 結果顯示：與D組相比，A、B、C三組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)；A、B、C三組兩兩之間比較無顯著差異(P>0.05)；具體結果見表1。

表1 CSU患者與健康對照組嗜堿粒細胞CD63+CD203c+表達情況

注：*A、B、C三組分別與健康對照D組比較，均P<0.05，有統計學意義；A、B、C三組間比較P>0.05，無統計學意義

圖1流式細胞儀檢測四組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化率

2.3 各組之間嗜堿粒細胞活化率情況，結果表明A、B、C組活化率明顯高于D組，見圖2。

圖2 各組嗜堿粒細胞CD63和CD203c活化百分率散點圖

3 討論

CSU是一種全身性的炎癥過敏性疾病，由于病因和發病機制不盡相同，風團持續時間也各不相同。部分患者風團持續<2 h能自行消退，也有患者風團持續12～24 h方可消退。在CSU，風團持續時間與患者生活質量密切相關，目前對于風團持續時間無明確劃分標準，有分為<2 h和超過2 h者，以及<24 h和超過24 h者[5]。我們前期曾使用iTRAQ技術鑒定和驗證了風團持續時間不同的CSU患者血清中差異表達的蛋白質，發現風團持續12～24 h組較<2 h組差異蛋白顯著[6]，因此本研究沿用前期使用的標準，以風團持續時間<2 h、12～24 h和治療后風團有效控制的CSU患者進行分組。

嗜堿粒細胞在慢性過敏性皮膚病中發揮著重要作用，與肥大細胞一樣，也是CSU的主要靶細胞[7]。嗜堿粒細胞有多種表面標志物，CD63和CD203c作為嗜堿粒細胞的主要激活標記物[8]，基于其表達代表胞內兩種不同的活化信號通路，且分別反映釋放組胺的不同方式，因此利用流式細胞術聯合檢測胞膜CD63、CD203c可全面評估CSU患者嗜堿粒細胞活化情況。

既往研究表明，在CSU，外周血嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達增加[9]，但表達水平與風團持續時間以及病情活動之間的關聯尚不清楚。本研究結果顯示，CSU風團持續時間不同的A、B兩組和風團消退、病情暫時控制C組較健康對照D組嗜堿粒細胞CD63和CD203c表達均顯著上調，這與Gentinetta等[10]、Yasnowsky等[11]研究結果一致，說明無論風團是否存在，活化的嗜堿粒細胞均參與疾病的過程。國內有學者發現嗜堿粒細胞在慢性蕁麻疹患者顯著高于急性蕁麻疹患者[12]，亦有研究得出相反的結論[13]。嗜堿粒細胞在CSU風團形成過程中的作用機制與環節尚不明確，本組研究還比較了風團存在的A、B兩組與風團暫時控制的C組嗜堿粒細胞CD63和CD203c的表達情況，結果顯示A、B組兩組與C組之間并無明顯差異，提示活化的嗜堿粒細胞參與了具有炎癥反應的風團形成過程。嗜堿粒細胞在慢性過敏性炎癥反應中起著引發劑的作用，而并非單一效應物。嗜堿粒細胞浸潤CSU患者的皮損中[14]，但嗜堿粒細胞的活化與風團持續時間無明顯相關。在CSU的發病過程中，除了嗜堿粒細胞，還有其它因素使風團持續存在，如肥大細胞和自身免疫抗體等。本實驗結果說明了活化的嗜堿粒細胞可能參與了風團的形成、發展，在風團消退病情暫時控制階段嗜堿粒細胞也起到一定的作用，這為臨床治療CSU時抗炎藥物選擇的時機提供了幫助。

CSU發病機制復雜，本研究進一步提示，活化的嗜堿粒細胞參與了CSU的發病過程，但與風團持續時間長短無明顯差異。由于本研究樣本量較小，這一結果有待進一步證實。