NT-P-BSA-ELISA在麻風血清學檢測中的應用

劉曉虹 靳亞莉 周曉維

麻風是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，盡管從40年代起就開展了以氨苯砜類藥物為主的化療，但迄今為止仍有多數國家尚未能達到控制和消滅麻風。我國麻風發病趨勢總體處于低流行狀態，仍位于世界前位[1]。麻風桿菌(ML)是麻風的病原體，在人體內主要侵犯皮膚、黏膜、周圍神經、淋巴結、網狀內皮系統以及橫紋肌等器官和組織。諸多研究表明其致病機制主要是由于機體對ML及其抗原成分發生的細胞和體液免疫反應的結果，麻風桿菌種屬特異抗原酚糖脂I(PGL-I)，是麻風血清學檢查使用最廣的抗原；使用單克隆和多克隆抗體法分析PGL-I分子上的抗原表位，表明其上3,6-二甲氧基葡糖殘基是重要的，并以此為基礎將其上的天然三糖結構(Natural Trisaccharide)通過連接臂苯丙酰基(Phenolic)或辛基(Octyl)連接到小牛血清蛋白(BSA)上而產生半合成糖蛋白抗原： NT-P-BSA，NT-O-BSA[2]。Izumi等[3]曾用NT-O-BSA建立明膠顆粒凝集實驗為現場應用。但其敏感性和特異性均較NT-P-BSA-IgM-ELISA低。本實驗擬通過 NT-P-BSA-IgM-ELISA(NT-IgM-ELISA)和NT-P-BSA-IgG-ELISA(NT-IgG-ELISA)的比較實驗，進一步評價兩法的敏感性和特異性，以期建立更加優化的方法。

1 材料和方法

1.1 受檢血清 麻風患者血清80份，來自于廣西皮膚病研究所。據臨床表現、細菌學、病理學和免疫學將麻風患者分為5型：結核樣型(TT)、界限偏結核樣型(BT)、中間界限型(BB)、界線類偏瘤型(BL)和瘤型(LL)。其中前兩型稱作少菌型(PB)30例，后三型稱作多菌型(MB)50例。正常人血清80份,來自大連市體檢中心，經檢測為正常人血清。結締組織疾病患者血清30份，銀屑病患者血清30份，妊娠血清30份，結核病患者血清30份，分別來自大連市皮膚病醫院、大連市婦產醫院和大連市胸科醫院。

1.2 抗原 NT-P-BSA抗原由日本奈良大學Fujiwara教授提供。用揮發性緩沖液將抗原配成濃度為0.1 ug/ml，按照每孔0.1 mL包被于96孔酶標板(Costar公司)，37℃ 18 h干燥后置4℃備用。

1.3 酶結合物和顯色劑 羊抗人HRP-IgM(型號D110157)，羊抗人HRP-IgG(型號D110117)購自Sigma公司，顯色劑為鄰苯二胺(OPD)購自Promega公司。

1.4 實驗方法 間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。采用吳勤學教授最適化后的NT-P-BSA-ELISA[4]。其簡要程序如下：用PBS(PH7.2)浸泡抗原包被96孔板(0.2 mL/孔)，37℃孵育20 min后倒去浸泡液，甩干，加入5%封閉液(SM-PBS)0.2 mL/孔，放置于37℃孵育2 h；甩干封閉液；加待檢血清用2.5% SM-PBS稀釋，每孔加0.1 mL，置于37℃孵育1 h；甩去血清，用PBS沖洗3遍扣干；加酶結合物按1∶1000稀釋(稀釋液為2.5% SM-PBS)，每孔0.1 mL，置37℃ 1 h；甩去酶結合物，用PBS沖洗3次。加0.01%底物液(OPD 10 mg，PH 5.0檸檬酸-磷酸鹽緩沖液99 mL，甲醇1 mL，30% H2O240 μL)，每孔0.1 mL，置37℃保溫30 min；加終止液(1.25 M的H2SO4)，每孔0.1 mL，立即在酶標儀(Bio-RAD)于波長為490 nm處讀OD值。每份血清加兩個孔，取平均值，兩孔值變化超過10%重復實驗。每板均設陽性對照，陰性對照及空白對照，用空白對照校零點。

1.5 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件,計算平均值、標準差、t檢驗﹑敏感性和特異性，陽性預測值和陰性預測值， P/N比值(患者平均值/正常人平均值)，折線圖。

2 結果

見表1。兩組實驗血清稀釋度在1∶200時P/N值均較1∶100大，我們實驗中選取血清的稀釋濃度為1∶200。

麻風患者皮膚組織切刮液查菌是診斷麻風的主要方法之一，我們將血清學結果與查菌的細菌指數(BI)進行作圖比較，結果見圖1。

表1 NT -IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA在血清濃度1∶200和1∶100時的實驗結果

注：P/N=患者血清OD平均值/正常人血清OD平均值

表2 用NT-IgM-ELISA和NT-IgG-ELISA檢測受檢對象血清抗體的結果

注：PB=少菌型患者，MB=多菌型患者，Nu=例數，NT-IgM-ELISA中t=7.98，P<0.05，NT-IgG-ELISA中t=7.56，P<0.05

表3 麻風患者與正常人的陽性預測值和陰性預測值

圖1 NT-P-BSA-IgM-ELISA中BI值與OD值的關系

從圖1、2可知(1)隨著細菌指數(BI)的增高，血清學檢測OD值也增高；(2)在BI為0時，OD值在0.08～0.26之間；(3)相同的BI值，不同的OD值。說明血清學較查菌方法敏感，可以早期監測病情變化；(4)BI在0～2之間時，圖1呈輕度上升趨勢，圖2曲線基本呈水平狀，說明NT -IgM-ELISA較NT -IgG-ELISA敏感性稍高。

圖2 NT-P-BSA-IgG-ELISA中BI值與OD值的關系

3 討論

本次NT-P-BSA-ELISA進一步證實麻風患者血清中存在抗NT-P-BSA的IgM和IgG抗體，且兩抗體檢測均對診斷麻風有意義，NT-IgM-ELISA的敏感性稍高于NT-IgG-ELISA，在多菌型麻風患者的檢出率較少菌型麻風患者檢出率高。較查菌方法，部分查菌陰性(BI=0)的患者血清學檢測為陽性，提示血清學方法可早期輔助診斷麻風。

妊娠個體，銀屑病和結核病患者的血清中檢測到了交叉抗NT-P-BSA的抗體，麻風桿菌和結核分枝桿菌同屬于分枝桿菌屬，有共同的種屬基因片段，及多種不同的可引起機體免疫應答的分枝桿菌脂抗原，而麻風桿菌的抗原大約為結核桿菌的1/3[5]，這可能是產生交叉反應的主要原因。至于妊娠個體的交叉，有人報道可高達10.8%(即使常規輸血者亦可高達10.6%)[6]，這可能是妊娠后機體機能的變化，產生某種與抗體結構相似的物質，這還有待進一步的研究。

多菌型麻風臨床特征明顯，實驗室檢測陽性率高，診斷通常不會出現障礙，少菌型麻風臨床特征常不典型，皮膚切刮液查菌常為陰性，所以需要有高敏感性實驗方法輔助診斷，以便早期發現，早期治療。另外麻風是皮膚病中的超級“模仿者”，被誤診的病種較多，如銀屑病、過敏性疾病、結締組織病等[6]，需要特異性較高實驗方法，用于鑒別診斷。

總之，NT-P-BSA-ELISA的敏感性和特異性均較高，可用于麻風的輔助診斷，治療情況及治愈后復發的監測，其中NT-IgM-ELISA敏感性和特異性均較NT-IgG-ELISA高。