磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶信號傳導通路在慢性阻塞性肺疾病發展“快”“慢”表型中的作用差異研究

馬紅霞，王兵

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種可防可治的疾病，主要臨床特征為持續氣流受限，與肺部、氣道對氣體或有害微粒的慢性異常反應有關［1］。COPD患者肺功能呈進行性下降，且其下降速度表現出兩種極端表型，一種是發展“快”，即發病短時間內病情迅速進展，全身狀況和肺功能迅速惡化；另外一種是發展“慢”，即發病很長時間內病情、全身狀況及肺功能相對穩定［2］。既往研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinosito1-3-kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號傳導通路通過調控炎性遞質釋放、炎性細胞活化及氣道重構等在慢性氣道炎性疾病中發揮重要作用［3］。本研究旨在探討PI3K/Akt信號傳導通路在COPD發展“快”“慢”表型中的作用差異，以期對COPD防治工作提供一定參考價值。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

1.1.1 納入標準 （1）年齡30～80歲；（2）未伴有嚴重α1-抗胰蛋白酶缺乏者；（3）近1個月內未服用激素及其他免疫抑制劑、未接受過脫敏治療者。

1.1.2 排除標準 （1）行人工機械通氣治療者；（2）伴有重度呼吸衰竭者〔動脈血氧分壓（PaO2）＜40 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），伴或不伴有動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）＞90 mm Hg〕；（3）合并活動性結核、肺癌、肺纖維化等其他類型嚴重慢性呼吸系統疾病者；（4）合并心力衰竭、糖尿病、高血壓等可能影響試驗結果的慢性疾病者；（5）合并肺性腦病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、任何部位遷延不愈或急慢性感染性疾病者；（6）無法準確提供病史及有精神疾病者。

1.2 一般資料 選取2017—2018年新疆醫科大學附屬中醫醫院呼吸科門診或住院的COPD患者116例，均符合2015年修訂版慢性阻塞性肺疾病全球防治創議（GOLD）中COPD的診斷標準［4］，其中發展“快”表型者26例（A組）、發展“慢”表型者90例（B組）。A組患者中男14例，女12例；年齡38～68歲，平均年齡（52.1±9.3）歲。B組患者中男46例，女44例；年齡37～69歲，平均年齡（52.8±9.4）歲。另選取同期新疆醫科大學附屬中醫醫院體檢中心體檢健康者90例作為對照組，其中男47例，女43例；年齡39～68歲，平均年齡（53.0±9.1）歲。三組患者性別（χ2=0.07）、年齡（F=0.10）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經新疆醫科大學附屬中醫醫院醫學倫理委員會審核批準，所有受試者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.3 診斷標準 （1）COPD發展“快”表型診斷標準：①體質指數＜21 kg/m2，②慢性阻塞性肺疾病評估測試（CAT）評分＞20分，③改良英國醫學研究學會呼吸困難指數（mMRC）≥3級，④年住院次數≥2次，⑤年急性加重次數≥3次，⑥病程≤5年但肺功能分級≥Ⅲ級；滿足⑥及①～⑤中任意兩個條件者為發展“快”表型。（2）COPD發展“慢”表型診斷標準：①體質指數≥21 kg/m2，②CAT評分≤20分，③mMRC≤2級，④年住院次數≤1次，⑤年急性加重次數≤2次，⑥病程≥15年但肺功能分級≤Ⅱ級；滿足⑥及①～⑤中任意兩個條件者為發展“慢”表型［5］。

1.4 觀察指標

1.4.1 PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、Akt及磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt） mRNA相對表達量 自NCBI中GEO數據庫中獲取PI3K和Akt基因信息，設計實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）引物，以cDNA為模板，采用qRT-PCR分析三組受試者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相對表達量。

1.4.2 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量采用Western blot法檢測PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量［6］，具體方法如下：采集三組受試者外周靜脈血2 ml，與15 μl PMSF和200 μl細胞裂解液進行勻漿，之后于冰上裂解30 min，4 ℃環境下12 000 r/min離心5 min（離心半徑60 cm），去上清液；將1/4倍量5×SDS上樣緩沖液與蛋白質樣品混合均勻，熱水煮沸7 min，用10%SDS-PAGE 115 V電泳，200 mA恒流2 h，濕轉至硝酸纖維膜上，再以5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉3 h，加一抗（即鼠抗人PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt，以1:500稀釋）。TBST洗膜3次，10 min/次，然后與結合有辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）（1:4 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，與化學發光試劑（ECL）反應，X線膠片曝光顯影。PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白含量測定采用灰度值掃描，并將β-actin作為內參，灰度值之比為蛋白相對表達量。

1.4.3 炎性細胞因子 抽取三組受試者外周靜脈血3 ml，離心，分離血漿并置于-80 ℃環境下保存備用。采用CBA流式液相多重蛋白定量技術檢測血漿白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。

1.4.4 肺功能指標 采用德國耶格MasterScreen PFT System肺功能儀檢測三組受試者第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）、用力肺活量占預計值百分比（FVC%pred）及第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV1/FVC）。記錄三組受試者mMRC評分、CAT評分，mMRC評分越高提示患者呼吸困難越嚴重，CAT評分越高提示患者肺功能越差［7］。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，符合正態分布的計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗。以（雙側）P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相對表達量三組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組和B組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相對表達量高于對照組，B組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt mRNA相對表達量低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量 三組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組和B組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量高于對照組，B組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 三組患者PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白相對表達量比較（x±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in the three groups

2.3 炎性細胞因子 三組患者血漿IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組和B組患者血漿IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平高于對照組，B組患者血漿IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 三組患者炎性細胞因子比較（x±s，ng/L）Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in the three groups

2.4 肺功能指標 三組患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC、mMRC評分、CAT評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組和B組患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC低于對照組，mMRC評分和CAT評分高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC高于A組，mMRC評分和CAT評分低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表 4）。

表4 三組患者肺功能指標比較（x±s）Table 4 Comparison of pulmonary function indexes in the three groups

3 討論

COPD是一種常見的呼吸系統疾病，也是全球范圍內發病率和病死率升高的重要原因之一［8］。臨床實踐中發現，COPD雖然呈進行性發展，但病情發展速度不同，主要表現為發展“快”“慢”兩種表型，而研究COPD發展“快”“慢”表型的發生機制對COPD防治工作具有重要參考價值。

PI3K/Akt信號傳導通路是細胞內的經典信號通路，其可參與細胞炎癥、細胞凋亡及自噬等環節［9］。PI3K是一個異源性二聚體，作為聯系細胞應答效應和外信號的中介分子，屬于催化磷酸肌醇3-OH端磷酸化的一類蛋白質家族，具有重要生物學特征［10-11］。Akt被稱為蛋白激酶B，是PI3K信號通路中的關鍵信號傳導分子，對細胞凋亡、增殖等具有重要調控作用［12］。近年來，PI3K/Akt信號傳導通路在COPD炎性反應機制及抗炎治療中的作用受到臨床關注［13］。本研究結果顯示，A組和B組患者PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt mRNA及蛋白相對表達量高于對照組，B組患者PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt mRNA及蛋白相對表達量低于A組，提示COPD發展“快”表型與PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt基因及蛋白表達上調有關。

既往研究表明，COPD患者氣道內存在炎性細胞活化及大量化學因子、細胞因子及炎性遞質，它們參與調節氣道炎性反應，其中TNF-α是COPD的主要細胞因子之一［14］。既往研究表明，TNF-α過度表達導致肺組織損傷加重及炎性反應慢性化，在COPD患者肺組織損傷過程中起重要作用［15］。近年來隨著臨床對炎性因子研究深入發現，IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子與COPD發生、發展密切相關［16］。本研究結果顯示，A組和B組患者血漿IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平高于對照組，B組患者血漿IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平低于A組，提示與COPD發展“慢”表型相比，COPD發展“快”表型患者氣道炎性反應更嚴重。本研究結果還顯示，A組和B組患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC低于對照組，mMRC評分和CAT評分高于對照組；B組患者FEV1%pred、FVC%pred、FEV1/FVC高于A組，mMRC評分和CAT評分低于A組，提示與COPD發展“慢”表型相比，COPD發展“快”表型患者肺功能更差。分析COPD發展“快”表型患者氣道炎性反應更嚴重、肺功能更差的機制可能與PI3K/Akt信號傳導通路有關：PI3K/Akt信號傳導通路能調控炎性遞質釋放、炎性細胞活化，其磷酸化使炎性遞質過度釋放，進而導致氣道重塑及氣管收縮，同時其產生的基質金屬蛋白酶（MMPs）、彈性蛋白酶等可破壞肺實質，導致肺功能迅速降低［17-21］。

綜上所述，COPD發展“快”表型與PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt基因及蛋白表達上調有關；與COPD發展“慢”表型相比，COPD發展“快”表型患者肺功能更差，可能與PI3K/Akt信號傳導通路調控炎性細胞因子有關，但具體作用機制仍有待進一步研究。此外，COPD和哮喘均是氣流受限疾病且存在明顯易感交互作用，故本研究未排除哮喘患者，可能在一定程度上影響研究結果。

作者貢獻：馬紅霞進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，進行結果分析與解釋，負責撰寫論文，負責文章的質量控制及審校；馬紅霞、王兵進行數據收集、整理、分析,對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。