復方增氧方耐缺氧作用及初步血清藥物化學研究

王天寧，萬志強，趙 彧，苗 磊，張榮榕，衣春光，樸松蘭

（1.長春中醫藥大學人參科學研究院，長春 130017；2.長春中醫藥大學教務處，長春 130017；3.長春中醫藥大學基礎醫學院，長春 130017；4.長春中醫藥大學臨床醫學院，長春 130017）

氧是人體新陳代謝的關鍵物質，是一切生命活動的第一需要，長期慢性缺氧，會使組織細胞活力降低，器官功能減退，免疫力下降，使原有疾病惡化。由于我國缺氧人群覆蓋范圍越來越廣，已經嚴重影響居民的生活質量，所以對于如何選擇一種關于提高缺氧耐受力方面合適的治療方式則變的尤為重要。目前西醫主要根據不同器官或不同部位缺氧癥狀進行相對應的補氧物理治療及補氧化學藥物治療，物理治療主要采用高壓氧艙。化學藥物治療主要采用藥物進行調控，如采用擴血管藥物氟桂利嗪、倍他司汀進行治療；中醫在治療“缺氧”方面，其治療方法分為外用手法治療及內服中藥治療，其中手法治療主要是采用針灸治療來緩解腦部缺氧癥狀。內服中藥治療往往是依據中醫辯證施治理論，通過“陰陽平衡、氣血雙補”的法則進行治療。運用中藥藥性、功效及君臣佐使配伍規律，結合臨床實踐，選取具有耐缺氧作用的中藥材如人參、丹參、枸杞、紅景天等中藥材，進行辨證施治的內服配伍中藥治療。

復方增氧方以人參-丹參藥對為基礎[1]，通過與長春中醫藥大學附屬醫院心腦內科，呼吸內科等中醫名家共同協商，根據中醫臨床經驗及文獻依據，確定加味有著“高原人參”美譽的紅景天藥材進行組方，其臨床應用表明具有良好的耐缺氧作用。運用現代藥理方法以缺氧小鼠模型、亞硝酸鈉中毒小鼠模型和急性腦缺血小鼠模型為受試對象，系統探討該增氧方提高缺氧耐受力藥效，在此基礎上，為了弄清該增氧方的藥效物質，采用血清藥物化學方法，探討了該增氧方在大鼠體內的藥效物質，為將其開發成高科技含量的保健食品提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 1）SPF級SD大鼠，體質量（230±10）g，雄性。購于長春宏達鼠廠，生產許可證號SCXK（吉）2008-0002。2）SPF級小鼠，體質量（20±2）g，雄性。購于長春宏達鼠廠，生產許可證號SCXK（吉）2008-0003。3）昆明種小鼠，體質量（20±2）g，雌雄各半。購于由長春宏達鼠廠，生產許可證號SCXK（吉）2014-0003。

1.2 試劑及儀器 1）試劑：復方增氧方、紅景天藥材、丹參藥材、人參藥材、紅景天膠囊、紅景天苷對照品、酪醇對照品、隱丹參酮對照品、丹參酮IIA對照品、丹參酮I對照品、人參皂苷Re 對照品、凡士林、鈉石灰、亞硝酸鈉。2）儀器：ALB-224萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）；Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB265-S十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；微型旋渦混合儀（VORTEX MIXER）；高速電動勻漿機（新寶儀器有限公司）；離心機（eppendprf AG）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 供試品制備 日服處方量為：紅景天4 g，丹參3 g，人參1 g。取丹參藥材，加5倍量65%乙醇，90 ℃回流提取2次，1 h/次；人參、紅景天藥材加6倍量70%乙醇，回流提取3次，1次/h；丹參、人參、紅景天藥渣：加7倍量水100 ℃煎煮1次，1 h、濃縮、減壓干燥（60～80 ℃）、粉碎，過80目篩，藥粉備用（8 g生藥量相當于藥粉2.4 g）。以蒸餾水調配至所所需濃度。

2 方法

2.1 耐缺氧實驗

2.1.1 常壓耐缺氧實驗 取雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只分別為空白組、陽性藥組（紅景天膠囊）、復方增氧方低劑量組、復方增氧方中劑量組、復方增氧方高劑量組，空白組給予等量蒸餾水，連續灌胃給藥30 h。將各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，分別放入有5 g鈉石灰的250 mL廣口瓶內，瓶口用凡士林涂抹蓋嚴，以保持密閉不透氣，以小鼠呼吸停止為指標，觀察記錄自小鼠放入瓶中起到小鼠死亡的時間[2]。通過對組方中藥材提取濃縮處理最終得出提取物服用量為2.4 g/d相當于生藥量8 g/d。按正常人體質量為60 kg計算，每kg體質量日服生藥量為8/60 = 0.133 g·kg-1·d-1。以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組則小鼠劑量為 0.133×10 = 1.333 g·kg-1·d-1。將 1.333 g·kg-1·d-1確定為中劑量，則其2倍為高劑量，其1/2為低劑量。具體給藥量見表1。

表1 小鼠耐缺氧實驗給藥量

2.1.2 亞硝酸鈉中毒存活實驗 取雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項下，空白組給予等量蒸餾水，連續灌胃給藥30 h。各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射給予220 mg/kg亞硝酸鈉，立即計時，記錄小鼠存活時間[3]。

2.1.3 急性腦缺血實驗 取雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項下，空白組給予等量蒸餾水，連續灌胃給藥30 h。各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，自頸部逐只斷頭，立即記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時間。小鼠斷頭后迅速于冰盒上取血腦組織，去除嗅球，濾紙吸干稱重，加9倍冰凍生理鹽水，用高速電動勻漿機勻漿，制成10%勻漿液，3000 r/min離心15 min，將離心好的勻漿取上清，用生理鹽水按1：9稀釋成1%腦組織勻漿液分裝到錐形瓶中備用。測定SOD和MDA的含量[4]。

2.1.4 小鼠游泳實驗及相關指標測定 取雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項下，空白組給予等量蒸餾水，連續灌胃給藥30 d。小鼠末次灌胃給藥1 h后，放入水溫（22±1）℃，水深30 cm的游泳池中，游泳20 min后，處死小鼠，收集小鼠肝臟組織，將肝組織勻漿，測定肝臟中SOD和MDA的含量[5-6]。

2.2 小鼠急性毒性試驗 選用昆明種小鼠20只，雌雄各半進行試驗，試驗期間，動物自由攝食和飲水，采取灌胃法給予受試物，樣品最大使用濃度為0.4 g/mL。稱取藥粉16.00 g，加無菌水至40 mL，灌胃容量為20 mL/kgBW，即以8.00 g/kgBW的劑量，灌胃2次，間隔6 h。灌胃劑量相當于16.00 g/kgBW（相當于人推薦日攝入量的400倍）。連續觀察14 d ，觀察并記錄動物的一般狀態，體重變化，中毒特征以及死亡情況等，測定最大耐受劑量（MTD）。

2.3 血清藥物化學初步研究

2.3.1 樣品制備 1）供試品制備：復方增氧方提取物的制備同1.3項下制備方法，并同法提取紅景天藥材陰性、丹參藥材陰性、人參藥材陰性、單味紅景天藥材、單味丹參藥材、單味人參藥材提取物。2）混合對照品制備：精密取紅景天苷2.09 mg，酪醇 1.97 mg，隱丹參酮1.98 mg，丹參酮I 2.04 mg，丹參酮IIA 2.51 mg，人參皂苷Re 1.97 mg，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容，0.45 um微濾膜過濾，制得混合對照品溶液。

2.3.2 給藥方法 取正常的SD大鼠70只，隨機分為7組，即空白組、單味紅景天藥材組、單味丹參藥材組、單味人參藥材組、復方增氧方提取物高劑量組、復方增氧方提取物中劑量組、復方增氧方提取物低劑量組，每組10只。每組給藥量見下表。1次/d，連續7 d；空白組給與等量蒸餾水灌胃。末次給藥前12 h禁食，自由飲水。給藥量按人每天生藥量乘以大鼠比例系數6.25。見表2。

表2 各組大鼠給藥量表

2.3.3 試樣處理及檢測 分別采取末次給藥后30 min、60 min、90 min、120 min的血清。取含藥血清1 mL置10 mL離心管中，加入硫酸銨0.36 g，快速混勻，分別加甲醇（1 mL/次，總計5 mL）充分混勻，12000 r/min離心10 min，上清液置80 ℃水浴鍋上蒸干，用微量移液器精密加入0.5 mL，并使殘渣充分溶解，0.45 μm有機微孔濾膜過濾，備用。 取同法處理好的含藥血清樣品、空白血清樣品、混合標準品、空白溶劑進入液相色譜儀，于高效液相色譜儀中進行測定。色譜條件：1）色譜柱：Alltima-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；2）流動相：乙腈（A）-水（B）；3）梯度洗脫：0～ 13 min，7.0% A；13～ 16 min，7.0% ～ 17.0%A；26～ 39 min，17.0% ～ 27.0%A；39～ 72 min，27.0%～50.0% A；72～84 min，59.0%～53.0% A；84～150 min，53% A；4）檢測波長：0～34 min，283 nm；34～55 min，223 nm；55～150 min，283 nm；5）體積流量：1 mL/min；6）柱溫：35 ℃；7）進樣量：20 μL。

2.3.4 方法學驗證 1）精密度試驗：取同一供試品溶液，按照2.3.3項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以隱丹參酮為參照峰，計算共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD值，結果表明18個共有峰的相對保留時間小于0.4%、相對峰面積的RSD均小于2%。說明儀器的精密度良好[7]。2）重復性試驗：取同一批次樣品6份，按照2.3.3項下制備方法制備供試品溶液、色譜條件進樣，記錄色譜圖。以隱丹參酮為參照峰，計算共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD值，結果表明，18個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均＜2%。說明該方法重復性良好。3）穩定性試驗：取同一供試品溶液，按照“2.3.3項下色譜條件”連續進樣6次，收集3、6、9、12、15、18小時色譜圖，以隱丹參酮為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值，結果顯示，18個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均＜2%。表明樣品的穩定性良好。

3 結果

3.1 復方增氧方對小鼠耐缺氧存活時間的影響 連續灌胃給藥30 d，與空白組比較，復方增氧方中、高組和陽性藥對照組小鼠存活時間均顯著增強，P＜0.05或P＜0.01，表明復方增氧方具有提高缺氧耐受力作用。見表3。

表3 小鼠耐缺氧存活時間比較

3.2 對腦組織及肝組織中SOD和MDA含量的影響 與空白組比較，復方增氧方中、高組和陽性藥對照組小鼠腦組織及肝組織中SOD顯著增強（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 小鼠腦組織、肝組織中SOD和MDA含量

3.3 小鼠急性毒性試驗結果 復方增氧方對2種性別的小鼠經口的最大量耐受劑量（MTD）均＞15 g/kgBW。急性毒性分級屬無毒級。見表5。

表5 小鼠急性毒性試驗結果

3.4 血清藥物化學相關成分判定 通過對采血時間進行對比研究發現，60 min采血圖譜（圖1）可以檢測到的色譜峰較多，且峰形較明顯，基線較平穩，分離度較好，因此可以確定采血時間點為大鼠給藥后60 min。通過藥材圖譜比對法判斷出9個入血的原型成分，1～3、6號峰來自于紅景天藥材，8～10號峰來自于丹參藥材，7號峰來自于人參藥材，4號峰為三中藥材血清共有峰，并通過對照品圖譜（圖2）比對指認出1、2、8、9、10號峰分別為紅景天苷、酪醇、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA。

圖1 色譜比對圖

圖2 混合標準品色譜圖

4 討論

復方增氧方在臨床上應用，有良好藥效。急性毒性試驗表明其安全無毒，藥效試驗表明，小鼠在常壓缺氧條件下，受缺氧因素損害，酸性代謝產物和二氧化碳蓄積，最終因腦組織缺氧而死亡。復方增氧方能顯著延長小鼠存活時間，說明有降低耗氧量的作用。亞硝酸鈉中毒實驗中，亞硝酸鈉為一種氧化劑，進入機體可使血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，最終導致機體器官、組織供氧不足而死亡。實驗結果顯示復方增氧方可顯著延長亞硝酸鈉中毒小鼠的存活時間，說明復方增氧方能提高對缺氧的耐受力。小鼠在急性腦缺血實驗斷頭后，腦供血中斷，腦組織內部貯存的一定能量可使斷頭小鼠維持一段時間的張口喘息，該模型簡單易行，是篩選藥物的有效方法。SOD是體內主要的抗氧化酶之一，可清除氧自由基，復原因自由基造成細胞傷害，從而減少神經細胞損傷[5]。MDA是膜脂過氧化最終產物，具有細胞毒性[8]。急性腦缺血實驗結果表明復方增氧方顯著延長小鼠斷頭后張口喘息時間。并通過增加SOD含量，降低MDA含量，來提高小鼠耐缺氧及抗氧化作用。

采用血清藥物化學方法對復方增氧方藥效物質進行測定，研究了灌胃給與大鼠一定量的耐缺氧方溶液后，通過自身代謝與吸收觀察藥物經體內代謝后在血液中的原型成分與代謝成分，從而能夠進一步發現藥物起效的具體成分。研究表明通過HPLC-DAD保留時間對照法，判斷出9個入血的原型成分，并且指認出其中1、2、8、9、10號峰分別為紅景天苷、酪醇、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA；針對這9個原型入血成分，與各藥材及其陰性樣品的血清色譜圖進行比對，將已確認出的9個原型成分進一步進行了藥材的歸屬，同時本實驗也對其給藥高、中、低劑量組的血清色譜圖進行比對分析，結果表明，隨著給藥劑量的增加，這些原型入血成分的含量也呈成正相增加，由此得出，作為君藥的紅景天，其起效成分主要為紅景天苷與酪醇，臣藥丹參的主要起效成分隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA，而人參中的人參皂苷作為有效成分可能是通過其代謝產物起效的，有文獻報道人參皂苷并不是完全以原藥形式吸收入血，而是通過酸堿水解、腸道菌群代謝或肝臟代謝變成水解物或代謝物，進而產生療效。故在考察人參皂苷的體內作用時，不能僅考慮原型藥物的作用，還要考慮其在體內是否代謝，代謝產物是否有活性及其活性強弱等因素[9]。