PKD1/HDAC5軸在心肌梗死大鼠損傷心肌組織修復中的作用

楊雷，劉萍，劉暖，陶玲玲，毛秉豫

國家心血管病中心公布的2017 中國心血管病報告指出，心血管病死亡率無論在城市還是農村，均高于所有其他疾病，其中，心肌梗死是引發死亡的重要原因之一，2015 年，急性心肌梗死患者的住院費用高達153.4 億元［1］。蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）廣泛參與多種細胞生理學進程，如信號轉導、蛋白輸送、增殖或凋亡等［2-3］，Ⅱa 類組蛋白去乙酰化酶5（Class Ⅱa histone deacetylase 5，HDAC5）是PKD1直接的下游靶標蛋白之一［2］。CID755673是經典的PKD1的特異性阻斷劑，廣泛應用于PKD1調控的信號通路的研究［4］。肌細胞增強因子2（myocyte enhancer 2，MEF2）是一種特定的促進肌細胞分化的轉錄因子，參與心肌的病理性重構，與心肌梗死和心力衰竭存在著緊密聯系［5］。心肌肌鈣蛋白I（cTn I）對于心肌的收縮和舒張進程起著重要的作用，也是心肌梗死病理檢測中判定心肌壞死的金指標之一［6］。

本課題組近年來致力于以“PKD1”為靶點的心肌梗死等缺血性心肌病的治療研究，結果顯示PKD1具有誘導大鼠骨髓源性內皮祖細胞分化形成新生血管管腔的作用［7］，還同時有促心肌梗死大鼠心肌組織內血管新生的作用［8］。本研究擬進一步探討PKD1/HDAC5軸在心肌梗死大鼠損傷心肌組織修復中的作用，為基于“PKD1”靶點的調控網絡繪制和新藥開發提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40 只雄性Wistar 大鼠，SPF 級，8 周齡，體質量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011，動物質量合格證號：11400700315978。

1.1.2 藥物與試劑 PKD1（美國Pierce公司）；CID755673（北京孚博生物科技有限公司）；一抗兔抗HDAC5 多克隆抗體、兔抗MEF2多克隆抗體、兔抗cTn I多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz生物技術公司）；山羊抗兔IgG二抗（武漢三鷹生物技術公司）；TUNEL 染色試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 病理切片機（CUT6062 型，德國SLEE 公司）；勻漿機（T10 型，德國IKA 公司）；垂直型電泳儀（PowerPac HC 型，美國BD 公司）；熒光顯微鏡（Nikon Tis 型，日本尼康公司），配套分析軟件NIS-Elements Software BR。

1.2 方法

1.2.1 模型構建及動物分組 根據隨機數字表法將大鼠劃分為4 組：假手術組、模型組、PKD1（2 mg·kg-1·d-1PKD1）組和阻斷劑CID755673（2 mg·kg-1·d-1PKD1+10 ng·kg-1·d-1CID755673）組，每組10 只。模型組采用經典的左冠狀動脈結扎術復制心肌梗死模型，假手術組開胸手術但沒有進行結扎處理。模型組和假手術組均給予同劑量的生理鹽水。尾靜脈注射，隔日1次，持續28 d。

1.2.2 HE染色 28 d后處死大鼠，取心尖部心肌組織，置入4%多聚甲醛浸泡固定12 h后，制作厚度為3～4 μm的組織切片，石蠟包埋作常規HE 染色，400 倍放大后取5 個不同視野觀察分析。

1.2.3 Masson染色 心肌組織應用堿性品紅和苯胺藍染色，光學顯微鏡下心肌組織染色為紅色，膠原纖維為藍綠色。采用NIS-Elements Software BR 軟件計算膠原容積分數（CVF），CVF=同一圖像視野下的膠原面積/該視野的總面積。

1.2.4 TUNEL 染色 取和HE 染色一致的石蠟切片，參照TUNEL 試劑盒說明書染色，細胞核DAPI 復染。熒光顯微鏡下正常細胞示藍色，陽性凋亡心肌細胞示紅色。每張切片選5個非重復視野，統計陽性細胞個數。

1.2.5 免疫組織化學染色 組織取材同HE 染色。脫蠟、水化、H2O2祛除組織玻片上的過氧化物酶活性后，抗原修復，山羊血清封閉后加入一抗HDAC5（1∶50）、MEF2（1∶200）、cTn I（1∶200）或β-actin（1∶100），4 ℃下孵育過夜，PBS 沖洗3 次；加入IgG二抗（1∶2 000），室溫下作用15 min。DAB顯色后鏡下觀察，陽性的細胞呈現棕褐色或棕黃色。400倍視野下取5個不重復視野/切片，計數陽性細胞數量。

1.2.6 免疫印跡檢測 取心尖部心肌組織，IKA-T10勻漿機制成組織勻漿后，BCA 法測定蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉移到PVDF膜，添加一抗HDAC5（1∶500）、MEF2（1∶200）、cTn I（1∶1 000）或β-actin（1∶200），4 ℃下孵育12 h，PBS液清洗3次，與IgG二抗（1∶2 000）孵育1 h后TBST洗膜，暗室曝光顯影。計算并記錄各樣本蛋白與β-actin灰度值之比。

1.3 統計學方法 使用SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，多組均數間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織病理變化的影響 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織細胞形態清晰，核占據細胞中央，心肌纖維中可見粉紅色閏盤橫貫和不同數量的毛細血管散布。模型組大鼠心肌組織呈現壞死組織典型特征：心肌纖維斷裂，細胞核模糊或消散，閏盤和橫紋消失，伴炎癥細胞浸潤和瘢痕組織增生。PKD1 組大鼠心肌壞死區域明顯減少，閏盤和橫紋可見，細胞核清晰，但略顯肥大，心肌纖維內毛細血管和紅細胞數量增多。CID755673組大鼠心肌組織梗死范圍和模型組相似，細胞核溶解消失明顯，可見明顯的瘢痕組織和炎癥細胞。見圖1A。Masson染色結果表明，假手術組大鼠心肌呈現規整的大片紅色心肌，間雜少量藍色的膠原纖維；與假手術組相比，模型組大鼠心肌藍色膠原纖維占比過半，CVF 值顯著升高（P＜0.05），少量紅色心肌散在分布；與模型組相比，PKD1 組大鼠以紅色心肌為主，藍色膠原纖維占比較低，CVF值顯著下降（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠心肌藍色膠原纖維占比較高，CVF 值顯著升高（P＜0.05），見圖1B、表1。

Tab.1 Effects of PKD1 on collagen volume fraction and apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction表1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織的膠原容積分數和心肌細胞凋亡數量的影響 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of PKD1 on collagen volume fraction and apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction表1 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織的膠原容積分數和心肌細胞凋亡數量的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，c與PKD1 組比較，P＜0.01

組別假手術組模型組PKD1組CID755673組F CVF（%）12.26±2.86 65.54±12.98a 13.52±2.82b 63.37±13.12ac 99.496＊＊TUNEL陽性細胞（個/視野）4.05±2.45 35.82±12.52a 4.36±2.48b 34.48±13.36ac 36.789＊＊

2.2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡變化的影響 TUNEL 染色結果顯示，假手術組大鼠鏡下視野表現以藍色熒光為主的正常心肌細胞，偶見發出紅色熒光的凋亡細胞；與假手術組相比，模型組大鼠視野中呈現紅色熒光的凋亡細胞數量顯著增多（P＜0.05）；與模型組相比，PKD1組大鼠呈現以藍色熒光為主的心肌細胞居多，凋亡細胞數量顯著減少（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠呈紅色熒光的凋亡細胞數量顯著增多（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 PKD1 對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I蛋白表達的影響 免疫組化染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織內HDAC5 和MEF2 陽性細胞的數量均較少，而cTn I 陽性細胞的數量較多；與假手術組相比，模型組大鼠殘存心肌組織內MEF2 陽性細胞的數量顯著增多（P＜0.05），而cTn I陽性細胞的數量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，PKD1組大鼠心肌組織內MEF2陽性細胞的數量顯著減少（P＜0.05），而HDAC5 和cTn I 陽性細胞的數量均顯著升高（P＜0.05）；與PKD1 組相比，CID755673 組大鼠MEF2 陽性細胞的數量顯著升高（P＜0.05），而HDAC5 和cTn I 陽性細胞的數量均顯著減少（P＜0.05）。蛋白免疫印跡結果顯示，HDAC5、MEF2 和cTn I 蛋白表達的變化趨勢和免疫組化結果相一致。見表2，圖3、4。

Fig.3 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction圖3 PKD1對心梗大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（免疫印跡）

3 討論

研究表明，心肌梗死后心肌細胞出現大量壞死和凋亡，肉芽組織機化取代壞死的心肌組織，心梗后3～4 周，肉芽組織轉變成瘢痕組織［9］，這與本研究模型組大鼠心肌組織病理變化相一致。心肌組織發生壞死、凋亡及瘢痕組織出現等病理變化嚴重影響著心肌細胞的能量代謝，破壞心肌組織的微血管，進而導致殘存的心肌細胞負荷加重，心肌細胞肥厚，肥厚的心肌細胞缺氧變性壞死、纖維化，進而引發心室重構，嚴重者進展為心力衰竭。基于此，減少心肌細胞凋亡，逆轉肥厚心肌以及減輕心肌纖維化進而逆轉重構的心室是治療心肌梗死的重要策略之一［10-11］。

Tab.2 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction表2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（n=10，±s）

Tab.2 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I in myocardium of rats with myocardial infarction表2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，c與PKD1組比較，P＜0.01

組別假手術組模型組PKD1組CID755673組F陽性細胞（個/視野）HDAC5 10.56±5.12 9.68±5.24 42.82±5.44ab 9.74±5.48c 95.172＊＊MEF2 14.48±6.56 48.54±6.76a 13.96±6.82b 46.62±6.64ac 82.896＊＊cTn I 75.65±11.25 18.88±10.84a 73.23±11.12b 19.44±10.76c 84.355＊＊蛋白表達（目的蛋白/β-actin）HDAC5 0.15±0.04 0.14±0.08 0.64±0.09ab 0.16±0.06c 121.094＊＊MEF2 0.26±0.12 0.72±0.16a 0.24±0.14b 0.74±0.18ac 33.538＊＊cTn I 0.82±0.18 0.39±0.12a 0.69±0.16ab 0.38±0.14ac 21.057＊＊

筆者前期研究顯示，PKD1具有上調血管內皮生長因子的表達和促進缺血心肌組織血管新生的作用［7-8,12］。本實驗的HE 染色結果證實，PKD1 組大鼠心肌組織內微血管和紅細胞數量均顯著增多，這與前期的研究結果相一致。Masson 染色結果證實，PKD1 組大鼠紅色心肌所占比例顯著升高；TUNEL染色結果證實，PKD1治療后心肌組織內凋亡的心肌細胞數量顯著減少。這表明，PKD1可能通過促進心肌梗死后心肌組織內新生血管的生成，增加心肌的微循環血供，從而使心肌細胞的凋亡數量下降，并減輕心肌的壞死和纖維化程度，修復缺血受損的心肌。PKD1的特異性阻斷劑CID755673可阻斷PKD1的上述有益作用，進一步表明PKD1 可能是促心肌梗死后缺血受損心肌修復的關鍵調控蛋白。

心肌細胞內的HDAC5 在正常情況下位于細胞核內，主要處于脫磷酸化失活狀態［2］，本實驗的免疫組化染色結果也證實了假手術組大鼠HDAC5 位于心肌細胞核內，但幾乎不表達。PKD1必須和其靶標蛋白HDAC5結合才能參與正常的生理活動，因此形成了一種特異的PKD1/HDAC5 軸［2-3］。PKD1/HDAC5 軸在心肌梗死后心肌組織修復中的作用之前少有報道。本研究中，模型組大鼠HDAC5的表達與假手術組差異無統計學意義，但在PKD1 的誘導干預下，HDAC5 的表達顯著上調，而CID755673 能夠阻斷PKD1誘導的HDAC5上調。這表明，HDAC5是在PKD1的調控作用下發揮生物學作用的。

HDAC5 激活后結合MEF2 并抑制MEF2 的表達進而抑制心肌細胞發生病理性肥大，參與逆轉病理性心肌肥厚的進程［13］。MEF2 能夠調控影響心肌細胞核轉位、細胞骨架重塑和線粒體網狀結構完整性的特異性相關基因表達，MEF2的表達上調會引發心肌的收縮和舒張功能障礙，心室腔擴張，心室重構，最終發生心力衰竭［14］。MEF2 還參與心肌的纖維化重塑進程，壓力負荷引發心室重構的動物模型實驗表明，敲除MEF2 基因的小鼠較未敲除的小鼠纖維化程度明顯減輕［15］。MEF2 還具有調控脂肪酸的氧化而影響線粒體的功能，進而影響心肌的能量代謝［16］。這表明，MEF2在心肌梗死、心功能衰竭等疾病進程中均發揮著重要的作用。本實驗中假手術組大鼠沒有受到病理性或者藥物干預性刺激時，MEF2表達很低；模型組大鼠殘存的心肌細胞明顯肥大，心肌纖維化程度明顯，且伴隨著MEF2 表達的顯著升高，這與Tóth 等［13］報道的研究結果相一致。PKD1干預后MEF2表達顯著下調，而CID755673能夠阻斷這一作用。這表明，PKD1 可能通過結合HDAC5 而抑制MEF2的表達進而逆轉心肌梗死后心室重構等不良反應，促進心肌梗死后受損心肌的修復。

cTn I是判定心肌損傷的金指標之一［6］。本研究顯示，假手術組大鼠心肌組織結構正常，cTn I 的表達也最高；模型組大鼠心肌組織損傷明顯，因而cTn I 表達顯著降低。PKD1 干預后cTn I 表達再次顯著升高，而CID755673可以阻斷cTn I 表達的升高。這表明，PKD1 與HDAC5 結合激活后可以促進損傷心肌的修復。這為基于“PKD1”靶點的蛋白調控網絡的構建和基于“PKD1”靶點開發治療心肌梗死的新藥提供了部分實驗數據支持。下一步的研究中，需要設計siPKD1，并以CID755673做對照，從細胞實驗水平進一步探討PKD1/HDAC5軸的生物學作用。

Fig.1 Effects of PKD1 on histopathological changes in rats with myocardial infarction圖1 PKD1對心肌梗死大鼠組織病理變化的影響

Fig.2 Effects of PKD1 on apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction圖2 PKD1對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡變化的影響（標尺為40 μm）

Fig.4 Effects of PKD1 on expressions of HDAC5,MEF2 and cTn I of myocardium in rats with myocardial infarction(Scale bar=40 μm)圖4 PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織中HDAC5、MEF2和cTn I表達的影響（免疫組化，標尺為40 μm）