金黃色葡萄球菌腸毒素C促進異基因骨髓移植小鼠早期T細胞重建

陳鏡如 梁惠 陳欣林 石明 黎誠耀 張玉明

1南方醫科大學南方醫院小兒科（廣州 510515）；2廣東醫科大學（廣東東莞 523808）

異基因骨髓移植（allogeneic bone marrow transplantation，allo-BMT）是治療血液系統疾病[1]、免疫缺陷病[2]及實體瘤[3]的有效治療手段，然而機體經allo-BMT放療預處理后，長時間處于免疫缺陷期，導致T細胞輸出的數量和功能下降[4-5]。而T細胞作為免疫的效應與調節細胞，在allo-BMT后可以為受體提供免疫保護，并且在移植物抗腫瘤效應中也起到關鍵性作用，T淋巴細胞的重建是allo-BMT后預后的重要指標[6]。因此移植后T淋巴細胞的早期重建是預防移植后感染及移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）的關鍵[7-8]。本研究設想在移植后通過給予一種加快T淋巴細胞增殖的物質看其是否能加速移植后的T細胞重建。金黃色葡萄球菌腸毒素C（staphylococcal enterotoxin C，SEC）[9-10]是一種超抗原（superantigen，SAg）[11]，無需經抗原提呈細胞加工處理，可直接與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子和T細胞受體的β鏈區域特異性結合[12]，微量即可刺激大量T細胞增殖，并能活化NK細胞、B細胞、分泌多種細胞因子[13]，如干擾素（interferon，IFN）[14]、白細胞介素2（interleukin 2，IL-2）[15]、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）[16]等。SEC為臨床用于惡性腫瘤化療輔助治療的藥物金葡素注射液，其給藥方便、高效且技術相對成熟、安全性有保障。本研究將其應用于allo-BMT，利用其非特異地刺激T細胞高效擴增的SAg特性[17]，探討其對移植后受體T細胞早期重建的影響，旨在探索一種既能有效促進allo-BMT后T細胞早期重建又易操作的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物供鼠：無特定病原體級（SPF級）健康C57BL/6小鼠（H-2Kb），受鼠：SPF級健康雄性BALB/c小鼠（H-2Kd）。鼠齡均為6～8周，雄性，20～30 g，均于南方醫科大學實驗動物中心訂購。無菌飼養于南方醫院實驗動物中心SPF大小鼠飼養區。提前1周購買小鼠并飼養于SPF小鼠飼養區內，讓其適應新環境，在此期間無精神及飲食異常，無外傷或其他疾病發生。實驗過程中對動物的處理符合醫學倫理學標準。

1.1.2 試劑及儀器PE-H-2Kb、PerCP/Cy5.5-CD45、FITC-CD4、APC-CD4、PE-CD8a 、PE-CD62L、FITCCD44、APC-CD8a、PE/Cy7-CD4均購于 BD 公司。SEC來源為臨床藥物金葡素注射液（SEC含量為10 ng/mL）。小鼠細胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α的ELISA檢測試劑盒（凱基公司）、流式細胞儀（LSRFortessa，BD公司）、微量注射器（Hamilton，26G）。

1.2 方法

1.2.1 異基因骨髓內骨髓移植（intra-bone marrow bone marrow transplantation，IBM-BMT）移植前12 h采用X線輻射儀（RS 2000，RadSource）對受鼠進行全身性照射預處理，照射總劑量為6.5 Gy[18]，劑量率為1 Gy/min。于SPF房的實驗臺取C57BL/6供鼠的股骨和脛骨（盡量去除肌肉）后，于無菌條件下取骨髓制成單細胞懸液，用自動細胞計數儀計數后將細胞密度調整為1×109/mL，冰上保存待移植。受鼠麻醉后，將其一側膝關節（常右側）屈曲以暴露脛骨頭關節面，用無菌26G針頭穿過關節囊在此關節面旋轉進針，突破骨平面后換用微量注射器迅速將10 μL供鼠骨髓細胞懸液注入受鼠脛骨骨髓腔內[19]。

1.2.2 實驗分組及給藥方法為了分析SEC對allo-BMT后免疫重建的影響，將BALB/c受鼠隨機分成兩組，分別為給藥組和給生理鹽水組，每組10只。實驗組SEC給藥劑量為單位體質量劑量（1 ng/g），折合成金葡素注射液單位體質量劑量為（100 μL/g），陰性對照組給予同等劑量的生理鹽水，兩組均為腹腔給藥每日一次，在給藥第14天以心臟采血法進行采血。血液樣品于添加EDTA抗凝劑的2 mL離心管中冰上保存，并盡快在4℃下2 000 r/min離心10 min分離出血漿，血漿保存于-70℃，3個月內用于ELISA檢測。

1.2.3 檢測兩組T細胞亞群移植2周后，取受鼠外周血，各樣品取100 μL，加入相應的熒光標記抗體（PE-H-2Kb、APC-CD8a、PE/Cy7-CD4、PerCP/Cy5.5-CD45），流式細胞儀檢查植入狀態，分析各組T細胞亞群比例。取脾臟（研磨成單細胞懸液），以PerCP/Cy5.5-CD45、APC-CD8a、PE/Cy7-CD4、PECD62L、FITC-CD44染色，流式細胞儀分析不同組CD44、CD62l在初始T淋巴細胞中的比例[20]。

1.2.4 檢測細胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α應用ELISA法檢測小鼠血漿中細胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α。取出已保存的血漿于室溫復融后待測。遵循ELISA試劑盒說明書進行操作，其步驟為：提前取出試劑盒室溫平衡30 min后，在96孔酶標板上分別設標準孔、空白孔及待測樣品孔。標準孔中準確加樣標準品100 μL；空白孔不加樣品和酶標試劑，其他步驟相同；待測樣品孔加入1∶1預先稀釋好的樣品100 μL（樣品稀釋液50 μL加待測血漿50 μL，樣品最終稀釋度為2倍）。加樣時需懸空加于酶標板孔底部，避免氣泡產生。并裁取合適大小的封板膜封住反應孔，置37℃孵箱孵育90 min后，甩盡孔內液體，在厚迭吸水紙上拍干，每孔加350 μL稀釋好的洗滌液，靜置30 s后甩盡孔內液體，同樣在厚迭吸水紙上拍干，重復5次。加入生物素化抗體工作液100 μL，37℃孵育60 min后洗板5次。避光加入已提前室溫平衡的酶結合物工作液100 μL/孔，封孔，37℃避光孵育30 min后洗板5次。加入100 μL/孔顯色劑，37℃避光顯色15 min后，加入100 μL/孔終止液，即刻測OD450值。根據標準品濃度和OD值繪制標準曲線，計算出各孔待測樣品的濃度。

1.3 統計學方法應用SPSS 20.0及Graphpad Prism5軟件包處理，進行Kaplan-Meier生存模型分析，并繪制生存曲線。采用兩獨立樣本t檢驗分析移植后各樣本中的外周血淋巴細胞亞群比例及血漿細胞因子分泌量。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 allo-BMT植入情況分析移植后2周，經進一步分析兩組受鼠的植入情況表明，兩組受鼠外周血CD45+細胞均表達供鼠C57BL/6的MHC分子H-2Kb，提示allo-BMT成功。見圖1。實驗組和對照組外周血CD45+細胞表達供鼠C57BL/6的MHC分子H-2Kb的比例分別為（97.78±0.393）%、（96.9±0.444）%。見圖2。實驗組重建效率優于對照組，結果說明兩組受鼠移植后均重建。

圖1 allo-BMT后2周各組受鼠H-2Kb和CD45+細胞植入情況Fig.1 Results of transplantation after allogeneic bone marrow transplantation in 2 weeks

圖2 allo-BMT后2周各組受鼠植入比例Fig.2 Transplantation ratio after allogeneic bone marrow transplantation in 2 weeks

2.2 移植后T細胞亞型的重建移植2周后，外周血中實驗組和對照組的受體小鼠CD8+T細胞組比例為（12.63±1.333）%、（6.67±0.535）%，組間差異有統計學意義（P＜0.01，圖3A）。外周血中實驗組的CD4+T細胞比例為（1.470±0.075）%，高于對照組（1.112±0.064）%，組間差異有統計學意義（P＜0.01，圖3B）。脾臟中實驗組和對照組的受體小鼠CD8+T細胞組比例為（10.73±0.279）%、（8.327±0.443）%，組間差異有統計學意義（P＜0.001，圖3C）。脾臟中實驗組的CD4+T細胞比例為（1.798±0.110）%，高于對照組（1.418±0.069）%，組間差異有統計學意義（P＜0.05，圖3D），說明SEC能加快移植后CD4+和CD8+T細胞數目的重建。

移植2周后，脾臟內兩組受鼠CD44-CD62L+初始CD8+T和初始CD4+T細胞百分比和總數分別為（13.74±0.770）%、（6.97±0.414）%，組間差異有統計學意義（P＜0.001，圖3E）；兩組受鼠CD44-CD62L+初始CD4+T細胞百分比和總數分別為（11.92±0.417）%、（6.66± 0.464）%，組間差異有統計學意義（P＜0.001，圖3F）。結果表明，SEC能加快移植后初始T細胞數目的擴增。

2.3 細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌量應用ELISA法檢測兩組受鼠移植2周后血漿中細胞因子IFN-γ的分泌水平分別為（230.0±13.170）pg/mL、（383.7 ± 49.220）pg/mL（P＜ 0.05，圖4A）；細胞因子IL-2的分泌水平分別為（12.38±0.759）pg/mL、（17.49 ± 1.434）pg/mL（P＜ 0.05，圖4B）；細胞因子TNF-α的分泌水平分別為（102.0±7.580）pg/mL、（144.9 ± 14.380）pg/mL（P＜ 0.05，圖4C）。結果表明，SEC能夠誘導受鼠淋巴細胞活化[15]，促進移植后T細胞分泌功能恢復。

2.4 體質量變化和生存率移植后1周內，各組受鼠均伴有活動減少，體質量減輕等情況，其中對照組受鼠表現嚴重，實驗組表現較輕，體質量下降較緩慢（P＜0.05，圖5A）。觀察各組小鼠的生存率，10 d內實驗組和對照組生存率分別為91.7%、71.4%，實驗組高于對照組（圖5B）。結果說明，SEC能促進移植后T細胞重建，從而獲得較高的生存率。

圖3 移植后T細胞亞型比較Fig.3 Comparison of T cell subtypes after transplantation

圖4 細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α分泌量Fig.4 Levels of IFN-gamma，IL-2 and TNF-alpha

圖5 兩組小鼠體質量變化和生存曲線Fig.5 Changes of body mass and survival curve of mice in two groups

3 討論

Allo-BMT后的相關并發癥（感染、GVHD及腫瘤復發等）是威脅受者長期存活和生存質量的重要因素，其發生率與移植后受者免疫重建的延遲與否及延遲程度相關。而allo-BMT前的放療預處理可導致胸腺上皮細胞損傷，以致T淋巴細胞數目及功能下降。并且allo-BMT后T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞在重建過程中，T淋巴細胞重建最緩慢[21]。因此如何加快allo-BMT后的免疫重建，尤其是T細胞的重建，是研究的關鍵。目前處于研究階段加快allo-BMT后T細胞重建的方法[22-24]有很多，本研究旨在找出一種物質既能操作簡單又能高效的加速其重建。本研究采用的是IBM-BMT技術，與經外周靜脈輸注造血干細胞的傳統移植方式相比，不僅可以降低預處理所需照射劑量[25]，而且IBM-BMT的技術能將一定量的供鼠T細胞帶入受鼠，恰好使SEC對T細胞的擴增效應能良好的發揮。本研究檢測了受鼠移植2周后外周血及脾臟中T細胞重建情況，結果實驗組的CD4+和CD8+T細胞和比例高于對照組，表明了allo-BMT聯合腹腔注射SEC能促進T淋巴細胞數量的增殖。同時本研究檢測了CD44-CD62L+初始CD4+T和初始CD8+T細胞，其比例明顯高于對照組，證實了allo-BMT聯合腹腔注射SEC促進了初始T細胞數量的增殖。在抗原活化后，T淋巴細胞經歷克隆擴增（增殖）過程并分化成效應細胞。增殖先于淋巴細胞的效應反應[26]。并且活化的淋巴細胞可合成分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子[27]。本研究證實了allo-BMT聯合腹腔注射SEC能促進T細胞分泌功能的恢復，提高生存率。本研究操作簡單，安全性和穩定性較高。

雖然本研究所使用的SEC來源于臨床藥物金葡素注射液，其用于惡性腫瘤化療輔助治療的安全性高，但將其用于allo-BMT后的副作用并不明確，仍需進一步探討。并且隨著學者們對SEC的廣泛研究，發現SEC有著多種分型[28]，需明確各種分型及具體作用再展開后續實驗，深入探討其作用機制及驅動調節通路。