Sestrin2在慢性腎功能不全小鼠動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用和機(jī)制

靳文 鄢文 李冬義 勞鈺 劉一炫 陳潔瓊 趙雅紅

廣東省第二人民醫(yī)院1心血管內(nèi)三科，2腫瘤一科（廣州 510317）

動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病具有高發(fā)病率、高致殘和致死率等特征，是世界范圍內(nèi)人群死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，已經(jīng)成為當(dāng)前迫切需要解決的重大公共衛(wèi)生問題[1]。近年來已有多種有效藥物和治療手段應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的防治，但是仍未能有效降低血栓性疾病的快速增長趨勢(shì)和危害。積極探索動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制，是提高血栓性疾病防治水平的關(guān)鍵。慢性腎臟病是動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的重要危險(xiǎn)因素，與動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的不良預(yù)后密切相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。

Sestrins是近年發(fā)現(xiàn)的一種進(jìn)化上高度保守的的細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，屬于Sestrins家族蛋白，其編碼基因位于6號(hào)染色體q臂21位點(diǎn)[2-3]。Sestrin2是Sestrins家族重要成員之一，具有抗氧化應(yīng)激和缺血再灌注損傷等作用[2-3]。多項(xiàng)研究結(jié)果提示Sestrin2可能具有直接或間接調(diào)控血栓形成作用[4-5]。為進(jìn)一步明確Sestrin2在慢性腎功能不全促動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用，本研究利用自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠，予以5/6腎大部分切除術(shù)制備慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，分析Sestrin2在血小板活化、血栓形成中的作用。本研究將有助于進(jìn)一步闡明動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型制備選擇30周齡高脂飲食飼養(yǎng)的SPF級(jí)雄性ApoE基因敲除小鼠[購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001]為研究對(duì)象，部分予以行5/6腎大部分切除術(shù)制備慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，部分予以行假手術(shù)。小鼠5/6腎大部分切除術(shù)的簡要操作如下：麻醉小鼠，待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，仰臥位固定小鼠，氣管插管并應(yīng)用小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸；沿小鼠腹中線作切口，依次剪開皮膚、筋膜、肌肉、腹膜，撕開左腎包膜，暴露左腎動(dòng)脈及其分支血管。結(jié)扎兩支前側(cè)分支血管中的一支及背側(cè)分支血管，以觀察到腎臟明顯變白為準(zhǔn)。術(shù)后逐層縫合。予以碘伏消毒皮膚切口。2周后以相同手術(shù)操作方式行右腎全切除，4周后成模。假手術(shù)小鼠操作程序除不結(jié)扎左腎動(dòng)脈分支和不切除右腎外，余操作程序同小鼠5/6腎大部分切除術(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)共計(jì)分為3組，分別為對(duì)照組（8只）、慢性腎功能不全組（8只）和Sestrin2激動(dòng)劑組（8只）。對(duì)照組予以行假手術(shù)，慢性腎功能不全組予以行5/6腎大部分切除術(shù)，Sestrin2激動(dòng)劑組是在模型組基礎(chǔ)上予以10 mg/kg Eupatilin灌胃1周，對(duì)照組和慢性腎功能不全組則予以等容量生理鹽水灌胃1周。1周后各組小鼠用于后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 檢測(cè)FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間采用FeCl3誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈血栓形成測(cè)定血栓形成時(shí)間，簡要操作如下：小鼠經(jīng)麻醉后無菌手術(shù)分離左側(cè)頸動(dòng)脈，經(jīng)壓力換能器與生物換能采集處理系統(tǒng)相連，連續(xù)檢測(cè)頸動(dòng)脈壓力；放入0.2 cm寬的封口膠條備用。在分離備用的頸動(dòng)脈環(huán)抱10%FeCl3溶液浸泡的濾紙條。通過觀察頸動(dòng)脈環(huán)抱的濾紙條的遠(yuǎn)心端頸動(dòng)脈壓力變化以反映血栓形成情況，連續(xù)監(jiān)測(cè)90 min。動(dòng)態(tài)觀察并記錄頸動(dòng)脈壓力變化。從開始給予頸動(dòng)脈環(huán)抱濾紙條至頸動(dòng)脈壓力降至最低所需的時(shí)間即為血栓形成時(shí)間。

1.4 檢測(cè)小鼠斷尾出血時(shí)間小鼠經(jīng)麻醉后，仰位放置于加熱板上，設(shè)定溫度為37℃，使其體溫保持恒定；在小鼠尾端2 mm處，用手術(shù)剪斷尾，并將鼠尾浸沒于裝有10 mL 37℃恒溫的生理鹽水，以斷尾開始至鼠尾出血停止約1 min為出血時(shí)間。

1.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法染色檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈血栓形成小鼠處死后分離左側(cè)頸動(dòng)脈，予以脫水，固定，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察血栓形成以及形態(tài)變化。

1.6 小鼠血漿和血小板的分離和制備將麻醉后的小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，沿胸骨左緣切開胸腔，暴露心臟，使用1 mL注射器針頭套上2 mL注射器針管進(jìn)行心尖取血，針管中預(yù)先加入100 μL 3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑。采血后拔去針頭，將血緩慢注入塑料離心管中；將血混勻后，室溫100×g離心10 min；吸取上層富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）至另一個(gè)新的塑料離心管中，加入 0.1 μg/mL PGE1，37℃孵育20 min；室溫400g離心10 min；離心后提取血漿用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，沉淀物以含0.02 U/mL三磷酸腺苷雙磷酸酶的Tyrode′s buffer重懸，制備成洗滌血小板懸液，調(diào)整血小板終濃度至109個(gè)/mL。

1.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)血小板內(nèi)ROS和P-selectin的表達(dá)的表達(dá)分別將熒光探針DCFH-DA（1∶1000）、抗體CD62p-FITC孵育血小板，37℃，30 min，流式上機(jī)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（meanfluorescenceindex，MFI）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.8 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)血小板Sestrin2的表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)Sestrin2蛋白水平表達(dá)。具體操作：首先提取血小板蛋白，將收集的血小板加入放射免疫沉淀分析裂解液，冰上孵育30 min，4℃12 000g離心30 min，將上清移至新的EP管中。接著，對(duì)提取蛋白進(jìn)行定量，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗4℃孵育過夜，1×TBS液洗滌3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗滌3次。最后，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，暗室曝光，分析讀取條帶灰度值。

1.9 檢測(cè)血漿肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的表達(dá)分別采用苦味酸速率比色法檢測(cè)血漿SCr、脲酶波氏比色法檢測(cè)血BUN的表達(dá)。具體操作參考試劑盒說明書。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間樣本的比較采用One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析方法，組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Welch法，組間多重比較則采用Dunnett′s T3。P＜0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sestrin2激動(dòng)劑促進(jìn)慢性腎功能不全小鼠血小板高表達(dá)Sestrin2WB檢測(cè)結(jié)果顯示：慢性腎功能不全小鼠血小板Sestrin2表達(dá)較對(duì)照組慢性降低（P＜0.05），Sestrin2激動(dòng)劑上調(diào)慢性腎功能不全小鼠血小板Sestrin2的表達(dá)（P＜0.05）。見圖1A。

2.2 Sestrin2激動(dòng)劑抑制慢性腎功能不全小鼠頸動(dòng)脈血栓形成FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間檢測(cè)結(jié)果顯示：慢性腎功能不全小鼠的頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間較對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），Sestrin2激動(dòng)劑能夠顯著延長慢性腎功能不全小鼠的頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間（P＜0.05）。見圖1B、C。

2.3 Sestrin2激動(dòng)劑不增加慢性腎功能不全小鼠出血風(fēng)險(xiǎn)鼠尾出血時(shí)間檢測(cè)結(jié)果顯示：慢性腎功能不全小鼠的鼠尾出血時(shí)間較對(duì)照組無顯著延長（P＞0.05），Sestrin2激動(dòng)劑不增加慢性腎功能不全小鼠鼠尾出血時(shí)間（P＞0.05）。見圖1D。

圖1 Sestrin2對(duì)慢性腎功能不全小鼠頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)間、斷尾出血時(shí)間的影響Fig.1 Effects of Sestrin 2 on carotid artery thrombosis time and tail-cutting bleeding time in mice with chronic renal insufficiency

2.4 Sestrin2激動(dòng)劑抑制慢性腎功能不全小鼠血小板ROS生成和P-selectin表達(dá)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：慢性腎功能不全小鼠的血小板ROS生成和P-selectin表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），Sestrin2激動(dòng)劑能夠顯著減少慢性腎功能不全小鼠的血小板ROS生成和P-selectin表達(dá)（P＜0.05）。見圖2。

2.5 Sestrin2激動(dòng)劑改善慢性腎功能不全小鼠腎功能比色法檢測(cè)結(jié)果顯示：慢性腎功能不全小鼠的血漿BUN和Cr較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），Sestrin2激動(dòng)劑能夠降低慢性腎功能不全小鼠的血漿BUN和Cr水平（P＜0.05）。見圖3。

圖2 Sestrin2對(duì)慢性腎功能不全小鼠血小板活性氧生成、P-selectin的影響Fig.2 Effects of Sestrin2 on platelet reactive oxygen species production and P-selectin in mice with chronic renal insufficiency

圖3 Sestrin2對(duì)慢性腎功能不全小鼠血漿BUN和血Cr的影響Fig.3 Effects of Sestrin 2 on plasma urea nitrogen and creatinine in mice with chronic renal insufficiency

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展主要是由血管內(nèi)皮損傷、血小板活性增強(qiáng)、凝血活性增強(qiáng)、抗凝活性減低等引起。其中，血小板的黏附、活化和聚集是維持血栓形成和出血之間平衡的重要環(huán)節(jié)[6-7]。血小板是血栓形成的主要介質(zhì)，抗血小板藥物是防治動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病的“基石”。目前臨床常用的抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等不同程度的降低了血栓性疾病的死亡風(fēng)險(xiǎn)，改善了血栓性疾病的預(yù)后。由于血栓性疾病病變程度和抗血小板藥物的療效和個(gè)體化反應(yīng)不同，依然存在“阿司匹林抵抗”和“氯吡格雷抵抗”等現(xiàn)象[8-9]，以及發(fā)生出血等不良事件。理想的抗血小板藥物應(yīng)當(dāng)具有高效的抗血栓形成能力和低出血風(fēng)險(xiǎn)，并具有心血管系統(tǒng)保護(hù)作用。因此尋找新的靶點(diǎn)，提高抗血栓能力，減少出血風(fēng)險(xiǎn)，降低心血管不良事件，是目前抗血小板藥物研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物Sestrins含有3個(gè)亞型，分別是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3，均具有抗氧化應(yīng)激的作用。其中，Sestrin2的抗氧化能力最強(qiáng)，研究最為廣泛。Sestrin2與血栓相關(guān)性疾病聯(lián)系密切。原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）是經(jīng)典ph（philadelphia）染色體陰性的骨髓增殖性腫瘤中最常見的亞型。血栓栓塞是ET最常見的并發(fā)癥。利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)檢測(cè)JAK2陰性ET患者的全方位遺傳信息顯示SESN2（Sestrin2編碼基因）、ST3、NTRK1、ABCB5、FRG1、ASNS、FRG1、ASNS、TOP1MT、DNAJC17等 8種基因突變與ET緊密相關(guān)，其中以SESN2基因突變與ET最為密切[4]；提示Sestrin2參與ET的血栓形成。為明確Sestrin2在慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)FeCl3誘導(dǎo)的慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠頸動(dòng)脈血栓形成能力顯著增強(qiáng)，血小板Sestrin2的表達(dá)降低；予以Sestrin2激動(dòng)劑Eupatilin干預(yù)后能夠抑制慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血栓形成，激活血小板Sestrin2表達(dá)；為明確Sestrin2參與血栓形成是否與凝血功能有關(guān)，本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)慢性腎功能不全以及Sestrin2激動(dòng)劑Eupatilin干預(yù)后小鼠鼠尾出血時(shí)間無顯著變化。以上研究結(jié)果提示Sestrin2主要通過調(diào)控血小板聚集功能參與慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血栓形成。

Sestrin2的晶體結(jié)構(gòu)主要為偽對(duì)稱的兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域：N末端結(jié)構(gòu)域通過其螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋氧化還原酶降低活性氧產(chǎn)生，C末端結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮抑制mTORC1的作用。以上從Sestrin2晶體結(jié)構(gòu)揭示了其降低ROS的積累以及抑制mTORC1的機(jī)制。除此之外，Sestrin2還可通過作用于5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）激活作為Rheb的GTPase活化蛋白的抑癌基因結(jié)節(jié)硬化癥蛋白2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2），使Rheb（一種Ras相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白）攜帶GDP而抑制mTORC1活性，作為亮氨酸感受器調(diào)控營養(yǎng)敏感性Rag鳥苷三磷酸酶（Guanosine triphosphatases，GTPases）抑制 mTORC1 活性[2-3，10-13]。ROS和mTORC1是調(diào)控血小板活化和血栓形成的重要分子[5]，Sestrin2通過作用于mTORC1、ROS等對(duì)急性心肌梗死和腦缺血梗死發(fā)揮保護(hù)作用[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性腎功能不全和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血小板ROS生成和P-selectin表達(dá)增加，Sestrin2激動(dòng)劑能夠抑制慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血小板ROS生成和P-selectin的表達(dá)，提示Sestrin2可能通過抑制ROS產(chǎn)生發(fā)揮抗血小板活化以及血栓形成。

已有研究認(rèn)為Sestrin2可減少腎臟氧化應(yīng)激、降低血壓、減少ROS產(chǎn)生[18]，本研究發(fā)現(xiàn)Sestrin2激動(dòng)劑Eupatilin能夠降低慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血漿尿素氮和血肌酐，提示Sestrin2可能參與慢性腎功能不全的病理生理過程。針對(duì)Sestrin2如何改善腎功能以及是否通過改善腎功能間接抑制血小板活化有待于進(jìn)一步研究。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)Sestrin2參與調(diào)控慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化性血栓的形成，Sestrin2可能是防控動(dòng)脈粥樣硬化性血栓的潛在作用靶點(diǎn)。本研究未能探討Sestrin2調(diào)控血小板活化及其在慢性腎功能不全合并動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成中的具體機(jī)制。在今后研究中，將對(duì)此展開深入探討。