miR-1調控靶基因HCN4在風濕性心臟病心房顫動中的作用

付勇 毛亮 李妙齡 于風旭 李新 廖斌 鄧明彬

1西南醫科大學附屬醫院心臟大血管外科（四川瀘洲646000）；2西南醫科大學心血管醫學研究所（四川瀘洲646000）

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床十分常見的一種室上性快速性心律失常，其表現為不協調的電活動導致心房收縮功能降低[1]。與竇性心律的人群相比較，心房顫動人群發生中風危險增加，隨著年齡增長中風發病率明顯增高，50歲卒中風險為7.2%～10.2%，70歲以上卒中風險為15.4%～19.1%[2]。大約30%的AF患者中風后在1年內死亡，高達30%的幸存者永久性殘疾[3]。風濕性心臟病（rheumatic heart disease，RHD）患者進行藥物、手術等治療，其房顫仍不能得到徹底治愈。對于其預防和治療，至今未有確切有效的方法和措施；AF發生的確切機制至今仍未明了。近年來，miRNA在房顫的發生中研究較多，學者認為miRNA不僅在于心臟損傷的標志，同時也可能參與AF的電-機械反應。miRNA是否通過其靶基因改變心肌細胞的電生理特性導致AF的發生。為了證明這一假說，筆者通過研究miR-1及其靶基因HCN4在風心病房顫中表達改變特點，探討AF可能的發生機制。

已有研究[4-5]表明miRNA可能參與心房顫動的發生。本文擬通過檢測心肌組織miR-1表達及其參與調控靶基因HCN4（hyperpolarization activated and cyclic nucleotide gate cation channel-4，HCN-4）可能的關系，探討其與心房顫動發生的可能關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院臨床診斷為RHD（簡稱風心病）行體外循環下瓣膜置換術患者36例。根據患者心臟節律不同分為心房顫動組（AF組，n=18）和竇性心律組（SR組，n=18），年齡分別為（47.20±8.81）歲和（44.40±14.41）歲。收集入選患者的術前臨床資料：一般資料、心電圖、超聲心動圖等。入選病例均除外合并慢性肺源性心臟病、甲狀腺功能亢進征、高血壓病、冠心病、病竇綜合征、心肌病、腎臟疾病、胺碘酮治療和二次接受心臟手術的患者。該實驗得到西南醫科大學附屬醫院倫理委員會同意。右心耳實驗取材參照文獻報道[6]。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料儀器：膜片鉗放大器（美國），離心機（湖南），分光光度儀（上海欣茂），垂直板電泳轉移裝置（上海天能），電泳儀（北京君意），多用脫色搖床（蘇州捷美），切片機（德國Leica），展片機（德國Leica），熒光定量PCR儀（加拿大），液氮罐（四川），滅菌鍋（上海），烘箱（上海一恒），高速離心機（上海安亭），移液器（芬蘭）。

試劑：蛋白裂解液（北京普利萊）、5×SDS上樣緩沖液（上海生工）、PVDF膜（Millipore公司，美國）、預染蛋白marker（Fermentas公司，加拿大）、anti-HCN4（Millipore公司，美國）、HRP二抗（Western Biotechnology）、內參一抗（Western Biotechnology）、二抗（Dako公司，丹麥）、DAB（Sigma公司，美國）、引物（Western Biotechnology），DEPC（Sigma公司，美國）。

1.2.2 miR-1/HCN4基因表達檢測方法TRIzol法抽提總RNA，紫外分光光度計測量OD260/OD280均在1.8～2.0之間，記錄總RNA濃度；反轉錄反應體系的配制（總體積20 μL），逆轉錄；引物設計、熒光定量PCR反應體系的配制（總體積50 μL），每一樣品重復操作3次，檢測結果取均值，熒光定量PCR的操作步驟詳見文獻報道[7]。引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences gene

1.2.3 免疫組化免疫組織化學SP法染色。常規脫蠟至水，抗原修復，室溫下封閉，HCN4單克隆抗體（1∶200），4℃孵育過夜。PBS液充分洗滌后，加生物素化山羊抗兔IgG抗體（1∶200）孵育30 min，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液（1∶200）孵育30 min，PBS液充分洗滌后，DAB 顯色，陽性表達呈棕褐色。具體方法參見文獻[8]。

1.2.4 HCN4蛋白表達每100 mg組織加入1 mL RIPA裂解液裂解組織塊，提取蛋白。SDS-PAGE電泳灌膠與上樣，加足夠的電泳液后按等量蛋白上樣，電泳、轉膜，用封閉液將對應的一抗稀釋，將膜與一抗溫育1.5 h或4℃孵育過夜，用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶5 000），然后與膜孵育1.5 h。顯色、曝光，對膠片進行掃描，然后用UVP凝膠圖象處理系統Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.2.5 膜片鉗檢測起搏電流（If）全細胞膜片鉗技術及記錄：取心房肌組織，急性酶分離后放入保護液中保存，實驗前將心肌細胞懸液加入浴槽中并加浴液至1 mL，在顯微鏡下選擇形態好，折光性好的細胞進行實驗。將灌有電極液的微管電極置于電極夾持器上，給予電極內一定正壓，用微電極操縱器控制微管電極浸入浴液，發放振幅5 mV，波寬150 ms的矩形脈沖作為參考脈沖。操縱微推進器使電極尖端貼附在細胞表面，加負壓（10～20 cm H2O柱）即可見應答電流下降為零，表明高阻封接形成（阻抗高達1 GΩ以上）。封接形成后，進行快電容補償。夾閉水柱，用1 mL注射器對細胞施加一短促的負壓抽吸破膜，即可形成全細胞膜片（whole-cell patch）。使保持電位-30 mV，鉗制電壓從-150～-40 mV，階躍-10 mV，持續2 s進行HCN4通道If電流的記錄。然后加入終濃度為4 mmol/L的CsCl阻斷HCN4通道，用以上方案記錄阻斷后電流。

1.3 統計學方法用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計，數據均采用表示；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-1表達miR-1相對表達量，結果顯示AF組miR-1基因表達小于SR組[（0.005 0±0.000 7）vs.（0.009 4 ± 0.002 5），P＜ 0.05]。見圖1。

2.2 HCN4表達HCN4基因表達水平AF組高于SR組[（0.255 2 ± 0.019 4）vs.（0.159 2 ± 0.013 1），P＜0.05]。見圖2。

圖1 右心耳miR-1 SR組和AF組表達水平比較Fig.1 Mean values of miR-1 and in right atrial appendage from sinus rhythm patients and atrial fibrillation patients

2.3 免疫組化AF組和SR組均存在HCN4蛋白表達，從組織棕褐色顆粒著色情況，AF組明顯多于SR組。見圖3。

2.4 HCN4蛋白表達HCN4蛋白表達水平AF組高于SR組[（1.1702±0.05598）vs.（0.3606±0.017 78），P＜0.05]。見圖4。

圖3 HCN4蛋白表達（SP×400）Fig.3 HCN4 protein expression in sinus rhythm group and atrial fibrillation group

圖4 SR組、AF組HCN4蛋白表達，HCN4（150 kDa），GAPDH（36 kDa）Fig.4 HCN4 protein expressionin right atrial appendag from sinus rhythm patients and atrial fibrillation patients HCN4（150 kDa），GAPDH（36 kDa）

2.4 If電流改變經全細胞膜片鉗技術進行If電流的記錄，右心耳心肌細胞起搏電流改變，從I-V曲線可見，If電流的幅值隨著刺激電位的增加，其電流密度逐漸增大，并且AF組If增加更為明顯，見圖5。穩態激活曲線顯示，AF組半穩態激活電壓（V1/2）為（-88±5.9）mV，穩態激活曲線斜率（K）為（8.2±1.8）；SR組V1/2為（-97±4.5）mV，K為（11.4±2.6）。見圖5。

3 討論

miRNAs是指長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，其在轉錄后調節在植物和動物的基因表達，調控約30%的蛋白編碼基因。目前研究發現miRNA與多種心血管疾病相關，其中研究較多的如 miRNA-1、miRNA-133、miRNA-208、miRNA-146a、miRNA-150、miRNA-19a 和 miRNA-375等參與心房顫動的發生和異常電活動的維持，這些miRNAs在不同環節參與心房的結構重構和電重構，從而在房顫的發生與維持中發揮重要作用[4，9-10]。

圖5 右心耳心肌細胞電流-電壓曲線和心肌細胞穩態激活曲線Fig.5 The myocardial cell current-voltage curve and steadystate activation curve in right atrial appendage

LI等[11]對冠狀動脈旁路移植術的患者進行基因和蛋白檢測，在高齡AF組中，檢測到microRNA-133和microRNA-1表達較對照組下調，發現HCN2和HCN4基因、蛋白表達水平較對照組升高，認為HCN通道被microRNA調控，microRNA-133、microRNA-1抑制HCN2、HCN4基因表達。

miR-1與靶基因HCN4mRNA的3′UTR區不完全互補結合，通過抑制HCN4 mRNA編碼蛋白質的翻譯過程來調控基因表達，可能miR-1抑制了HCN4的表達。通過檢測右心耳組織miR-1基因在風心病房顫患者中表達下調，可能通過miR-1與HCN4RNA誘導形成沉默復合體減少，對HCN4 mRNA表達的抑制減弱，在房顫患者中右心耳組織HCN4基因過表達。HCN4基因表達與其蛋白表達相關，在風心病房顫患者中右心耳組織HCN4蛋白檢測表達水平高于竇性心律患者。

竇房結正常起搏電活動依賴竇房結細胞Ⅳ期自動去極化，正常情況下竇房結起搏頻率高于心房搏動頻率，心房異位節律被壓制，表現為竇性心律。DIFRANCESCO[12]認為竇房結組織中 HCN4是具有起搏功能的標志基因，在對兔的研究中發現HCN4的表達水平與If電流密度密切相關，心肌肥厚或心功能衰竭中HCN4表達上調[13]，心房顫動患者中也存在HCN4表達上調[14]，可能導致If電流改變，心房異位自發起搏的發生，其頻率高于竇房結頻率，可能竇房結超速壓抑失控，表現為心房顫動[15]；通過檢測風濕性心臟病患者右心耳組織HCN4基因表達，結果表明AF組HCN4基因表達較SR組高，HCN4基因在房顫患者心房肌的異常增高表達，可能改變其主導的K+、Na+混合通道If電流的改變[16]，參與心房肌細胞舒張期興奮性的提高，導致心房肌易激惹。通過檢測If電流半穩態激活電壓，房顫時激活曲線右移，表明房顫在較低的電壓水平就可以達到半激活電流，更易于激活自發電流發生，影響起搏節律的穩定性[7]；在風心病房顫患者中miR-1表達下調，可能通過調控HCN4表達增高，心房肌細胞興奮性的提高，導致心房肌易激惹，參與風心病房顫的發生。