EphA2和Twist蛋白在宮頸病變中的表達及與宮頸癌患者預后的關系

葉俊良 陳曉宇 趙衛東 陳先俠

1安徽省婦幼保健院（合肥 230001）；2中國科學技術大學附屬第一醫院婦科（合肥 230001）；3安徽醫科大學組胚教研室（合肥 230032）

在婦科惡性腫瘤中宮頸癌發病占第2位。宮頸癌早期即有侵襲性和遠處轉移特點，其發病機制目前尚未完全清楚，因此探討其發病機制，將為其預防和治療提供理論依據[1]。在惡性腫瘤的浸潤生長中，快速增長的惡性腫瘤可通過血管生成擬態（vasculogenic mimicry，VM）而供氧，上皮細胞激酶（epithelial cell kinase，EphA2）是重要的VM相關信號轉導蛋白，其在黑色素瘤、乳腺癌[2]細胞生長中呈高表達，抑制EphA2蛋白表達，可抑制腫瘤的生長。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞向間充質轉化，在腫瘤發生和浸潤生長中作用顯著[3]。轉錄因子Twist與細胞遷移調控相關；同時，Twist具有癌基因特點，高表達于惡性腫瘤中，通過調控EMT干預腫瘤的侵襲性[4]。在宮頸癌發病機制研究中，檢測VM相關蛋白EphA2和轉錄因子Twist蛋白，及其表達與宮頸癌關系尚未見文獻報道。本研究檢測近年我院宮頸癌和上皮瘤變患者術后病變組織中EphA2、Twist蛋白表達情況，分析兩者對宮頸癌可能的預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集96例2013年11月至2018年10月安徽醫科大學婦幼保健醫院因宮頸癌入院患者，患者均經術后病理學證實，按照2009年國際婦產科聯盟（FIGO）宮頸癌臨床分期標準，96例宮頸癌中Ⅰa期27例，Ⅰb期36例，Ⅱa期33例，病理類型：宮頸鱗狀細胞癌62例，腺癌25例，腺鱗癌9例。同時收集26例宮頸上皮瘤變的宮頸組織錐切術后標本。122例患者年齡29～71歲，平均（38.6±12.7）歲。患者均無其他較為嚴重的合并癥，術前均未接受放療或化療處理。取部分組織置10%福爾馬林溶液中固定，另取標本液氮中凍存，擬行蛋白免疫印跡用。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者對研究均知情，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑Ⅰ抗：兔抗人Twist、EphA2多克隆抗體（美國Santa Cruz生物技術公司）；內參照兔抗人β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司）；抗原修復液、通用型二抗、DAB顯色劑、蘇木精、PBS緩沖液、中性樹脂（北京中杉金橋有限公司），蛋白裂解液（美國Sigma公司），BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光顯色液（美國Bio-rad公司）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 免疫組化染色及結果判斷免疫組化SP法檢測宮頸腫瘤組織中EphA2、Twist蛋白表達，簡要步驟如下。10%福爾馬林溶液固定手術標本，石蠟包埋，3 μm厚切片，二甲苯脫蠟，100%、95%、80%乙醇浸泡至水，微波枸櫞酸鈉溶液抗原修復，室溫羊血清封閉抗原20 min，滴加兔抗人多克隆一抗（Twist，1∶300稀釋；EphA2，1∶200稀釋），4 ℃孵育過夜；次日，PBS清洗，滴加羊抗兔二抗50 μL室溫孵育1 h，DAB顯色，顯微鏡下檢查染色情況，流水沖洗中止反應，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡檢。判定EphA2、Twist免疫組化染色結果由3名病理科醫生獨立完成，參照文獻[5]的方法，按照細胞質（或核）染色呈黃色或棕黃色判定為陽性細胞；（1）記錄陽性染色細胞占總細胞的百分比（×40倍物鏡下），每張切片隨機記錄5個視野，0分，0% ～10%；1分，10% ～25%；2分，26% ～50%；3分，50%～75%；4分，＞75%。（2）記錄陽性細胞染色程度，0分，陰性，無著色；1分，弱陽性“+”，呈淺黃色；2分，陽性“++”，呈黃色；3分，強陽性“+++”，呈棕褐色。判斷EphA2、Twist蛋白免疫組化結果濃度分布評分，采取兩項乘積，0分，陰性；低表達，1～4分；高表達，＞4分。

1.4 WesternBlot檢測宮頸病變組織中EphA2、Twist蛋白表達 隨機取手術切除宮頸病變組織，每組5例，液氮凍存。行Western Blot檢查時，先加入RIPA裂解液裂解宮頸腫瘤組織研磨呈粉狀，超聲破碎，應用BCA法測定樣品蛋白濃度，定量后總蛋白上樣量30 μg，SDS-PAGE電泳，濃縮膠（電壓60 V）-分離膠（電壓100 V）電泳1.5 h，PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉。加入Ⅰ抗兔抗人多克隆抗體（Twist，1∶2 500稀釋；EphA2，1∶2 000稀釋；β-actin，1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜，次日，洗膜后分別加入辣根酶標記的羊抗兔二抗孵育1 h，ECL化學發光顯影，曝光，采用Image J軟件計算條帶灰度，以β-actin為內參，目標蛋白相對表達水平采用EphA2、Twist蛋白和β-actin比值表示。

1.5 隨訪采取門診復查和電話等方式隨訪，以手術日開始患者生存期，截止期為2018年10月，6例患者失訪，隨訪3～60個月，中位隨訪時間為36個月，死亡9例，其中Ⅰa期1例，Ⅰb期4例，Ⅱa期患者4例。

1.6 統計學方法實驗數據處理采用SPSS 22.0軟件包，EphA2、Twist蛋白表達水平與臨床病理間聯系采用獨立樣本t檢驗，蛋白相對表達量采用表示，Kaplan-Meier法分析宮頸腫瘤陽性蛋白表達與患者生存率聯系，Log-rank檢驗患者生存率曲線，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EphA2、Twist蛋白在宮頸病變組織中的表達EphA2蛋白在宮頸腫瘤組織中主要表達于細胞質、細胞核，呈黃色或棕黃色，在宮頸上皮瘤變組織、Ⅰa期宮頸癌、Ⅰb期宮頸癌、Ⅱa期宮頸癌中陰性、低表達率與高表達率分別為38.5%（10/26）、42.3%（11/26）、19.2%（5/26）；24.2%（8/33）、45.5%（15/33）、33.3%（10/33）；16.7%（6/36）、52.8%（19/36）、30.6%（11/36）；7.4%（2/27）、48.1%（13/27）、44.4%（12/27）。結果表明，隨著宮頸腫瘤組織病理分期升高，EphA2的表達逐漸升高，在Figo臨床分期中，Ⅰb期、Ⅱa期宮頸癌與上皮瘤變比較差異有顯著性（P＜0.05，表1、圖1）。Twist蛋白在宮頸腫瘤組織中主要表達于細胞質、細胞核，呈黃色或棕黃色，在宮頸上皮瘤變組織、Ⅰa期宮頸癌、Ⅰb期宮頸癌、Ⅱa期宮頸癌中陰性、低表達率與高表達率分別為42.3%（11/26）、46.2%（12/26）、11.5%（3/26）；33.3%（9/33）、48.5%（16/33）、24.2%（8/33）%；22.2%（8/36）、52.8%（19/36）、25.0%（9/36）；11.1%（3/27）、51.9%（14/27）、37.0%（10/27）。結果表明，隨著宮頸癌組織病理分期升高，Twist蛋白表達逐漸升高，與上皮瘤變組織中Twist蛋白表達比較差異有顯著性（P＜0.05，表1、圖2）。

圖1 宮頸腫瘤組織中EphA2蛋白陽性表達（SP×400）Fig.1 The positive expression of protein EphA2 in cervical tumor tissues（SP × 400）

圖2 宮頸腫瘤組織中Twist蛋白陽性表達（SP×400）Fig.2 The positive expression of Twist protein in cervical tumor tissues（SP × 400）

表1 EphA2與Twist蛋白在宮頸腫瘤組織中的表達Tab.1 The expression of EphA2 and Twist proteins in cervical tumor tissues 例

2.2 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征相關性本研究探討96例宮頸癌組織中EphA2、Twist表達與患者臨床病理特征間的相關性，結果表明，腫瘤深肌層浸潤程度、淋巴結轉移有相關性（P＜0.05，P＜0.01）；兩種蛋白表達與年齡、腫瘤類型、Figo臨床分期、腫瘤大小無相關性，差異無統計學意義（P＞0.05，表2）。

2.3 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸病變患者預后的相關性分析對26例子宮頸上皮瘤變、96例宮頸癌患者隨訪情況，其中5例失訪，14例死亡，中位隨訪時間36個月，EphA2蛋白表達為陰性患者病死率為0%（0/26），低表達患者病死率為6.89%（4/58），高表達患者病死率為 26.32%（10/38）。Twist蛋白表達為陰性患者病死率為0%（0/31），低表達患者病死率為9.84%（6/61），高表達患者病死率為26.67%（8/30）。Log rank檢驗表明，EphA2和Twist蛋白表達水平不同，生存率差異有顯著性（χ2=12.663、19.916，P＜0.01）。見圖3。

2.4 WesternBlot檢測 EphA2和Twist蛋白在不同分期宮頸病變中的表達Western Blot結果表明，宮頸上皮瘤變組織中EphA2和Twist蛋白表達較弱，Ⅰa級宮頸癌組織蛋白的表達增強，且隨著病理分期升高，EphA2和Twist蛋白的表達增強（圖4A）。由圖像分析可知，與宮頸上皮瘤變組織比較，宮頸癌組織中EphA2/β-actin和Twist/β-actin相對蛋白表達量明顯升高（圖4B）。

3 討論

宮頸癌的發病機制目前未明，探明其發生機制可為治療提供新的理論依據。目前，經典的血管內皮生成的理論認為，為獲取充足營養，直徑＞2 mm實體腫瘤需要新生血管，在血管生成因子誘導下，惡性腫瘤細胞破壞血管內皮基底膜，形成有孔內皮和片狀基膜，同時，抗血管生成可有效治療腫瘤[6]。1999年，MANIOTIS等研究眼黑色素瘤微循環時，提出不依賴內皮的新型腫瘤微循環模式，即VM。在腫瘤細胞EMT過程中，起源于中胚層的血管間葉組織代替起源于內胚層的上皮組成，在腫瘤細胞周圍形成管樣結構，模擬血管功能，血細胞可以在此類管道樣結構中流動，供給腫瘤組織營養。隨后，在肝癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌的研究中也發現存在VM[3-4，7]，且與腫瘤的生長、分化、侵襲性等相關。VM相關的信號通路關鍵蛋白EphA2為受體蛋白酪氨酸激酶，可調節血管生成，已有研究[8]證實，在惡性黑色素瘤干預中，通過抑制EphA2的表達，顯著抑制黑色素瘤的增殖。本研究通過免疫組織化學和Western Blot均證實，在臨床高分期的宮頸癌中，EphA2表達較上皮瘤變和低分期宮頸癌明顯，且EphA2高表達與宮頸癌的復發呈正相關。這為可能利用干預EphA2表達治療宮頸癌提供理論依據。

表2 EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征比較Tab.2 Comparison of EphA2 and Twist protein expression with clinicopathological features of cervical cancer例

圖3 宮頸病變中兩種蛋白表達與Kaplan-Meier生存曲線Fig.3 The expression of EphA2 and Twist proteins in cervical tumor tissues and the Kaplan-Meier survival curve

圖4 蛋白免疫印跡檢測EphA2和Twist蛋白在不同分期宮頸癌組織中的表達Fig.4 The expression of EphA2 and Twist protein in different stages

宮頸癌的發病中，存在癌基因激活、信號轉導失調、細胞凋亡抑制等機制[9]。轉錄調節因子Twist參與胚胎發育和新血管生成，調控EMT，常染色體編碼的Twist基因位于堿性螺旋-環-螺旋，能夠調節組織重建，細胞遷移，過量表達的Twist基因能夠促進細胞惡性表型的轉化，在特定的情況下，可以促進上皮細胞向間充質細胞轉化、增強細胞運動和遷移能力，在腫瘤發生、發展和浸潤轉移中作用明顯[10]。本研究結果表明，與宮頸上皮瘤變相比，宮頸癌中Twist蛋白表達明顯上升，且高級別臨床分期的宮頸癌中，Twist蛋白表達更為明顯，故Twist蛋白參與宮頸癌的發生、發展。在宮頸腫瘤預后中，Twist蛋白表達為陰性患者無病死，而高表達Twist蛋白的宮頸癌患者病死率顯著升高，說明Twist蛋白的表達在宮頸癌患者預后中可能有一定的應用價值。

本研究同時比較了EphA2和Twist蛋白與96例宮頸癌臨床病理參數間的聯系，結果表明，EphA2和Twist蛋白表達與宮頸癌患者組織學分化級別、腫瘤深肌層浸潤程度、淋巴結轉移有相關性，而與與年齡、腫瘤類型、Figo臨床分期、腫瘤大小無相關性。可見EphA2和Twist蛋白在宮頸癌的進展、轉移中起重要作用。同時，值得注意的是，雖然宮頸癌組織中EphA2和Twist蛋白與宮頸上皮瘤變中有差異性，但在Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa級宮頸癌組織中表達無差異性，有待進一步擴大病例數，減小分析過程中可能出現的偏倚情況；同時，近期隨訪時間不足有待進一步完善。下一步筆者將在擴大樣本的基礎上，進一步分析聯合檢測EphA2和Twist蛋白在宮頸癌發生發展中的意義。