普魯卡因聯合肌成束蛋白1對膀胱癌細胞的影響及機制研究

方潔，朱建坡，張虎，呂志峰#，張淑香

河南中醫藥大學第一附屬醫院1麻醉科，2血液腫瘤科，鄭州 450000

膀胱癌是常見的泌尿系統腫瘤之一，發病率逐 年上升[1]。惡性腫瘤的發生發展與抑癌基因失活、原癌基因激活等密切相關，如何激活已經失活的抑癌基因，使其重新獲得活性已成為抗腫瘤基因治療的熱點。肌成束蛋白1（fascin 1，FSCN1）最早于海膽的卵母細胞質中被發現，屬于肌動蛋白結合蛋白家族成員，在人體正常組織中的表達水平相對較少，而在多種惡性腫瘤組織中表達上調[2-3]。研究顯示，抑制FSCN1的表達可降低乳腺癌細胞的增殖能力[4]，miRNA-145可靶向抑制FSCN1的表達，從而抑制前列腺癌和胃癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力[5-6]。研究發現，抑制FSCN1的表達可抑制膀胱癌細胞的增殖能力[7]，但FSCN1對膀胱癌細胞凋亡的影響及具體的作用機制尚未明確。普魯卡因是一種較為安全的局部麻醉藥物，研究表明，普魯卡因可抑制膀胱癌、鼻咽癌等腫瘤細胞的生長[8-9]。若FSCN1基因可增加普魯卡因對膀胱癌細胞的生長抑制作用，這將明顯有助于膀胱癌的治療。信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）可參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學過程，并在多種腫瘤細胞中異常激活，磷酸化STAT3（phospho-STAT3，p-STAT3）也與腫瘤細胞的轉移和侵襲密切相關[10]。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，在膀胱癌中過表達，參與膀胱癌細胞的侵襲和轉移過程[11]。Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）是促凋亡因子，其表達情況可間接反映細胞的凋亡情況。本研究通過干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制膀胱癌細胞FSCN1基因的表達，探討FSCN1siRNA聯合普魯卡因對膀胱癌細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響及作用機制，以期為膀胱癌的治療提供理論基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

人膀胱癌T24細胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫。RPMI 1640培養液、胎牛血清均購自美國GIBCO公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）溶液購自美國Sigma公司，膜聯蛋白V（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購自美國CST公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗購自美國Thermo Scientific公司，酶標儀購自美國BIO-RAD公司，流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及轉染采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基常規培養人膀胱癌T24細胞，置于37℃、5%CO2培養箱培養。取對數生長期的細胞，以5×105/ml的濃度接種于6孔板。當細胞融合度為70%時，將陰性對照的siRNA和FSCN1siRNA分別轉染至人膀胱癌T24細胞，分別作為NC組和si-FSCN1組，將僅加入LipofectamineTM2000的T24細胞作為對照組，補加培養液至2 ml，轉染體積為100 pmol，轉染5～6 h，更換為含血清及青霉素和鏈霉素的培養基繼續培養48 h。

1.2.2 細胞處理及分組取轉染后的NC組、si-FSCN1組T24細胞，分別向其中加入4 mmol/L的普魯卡因處理48 h，分別作為普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組；未加入普魯卡因的對照組T24細胞不進行特殊處理。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期分布情況取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞，預冷后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，400 μl的1×結合緩沖液（binding buffer）重懸細胞（約含有 1×106個細胞），緩慢加入1 ml的70%預冷乙醇，于4℃冰箱中固定過夜，PBS沖洗，加入含有100 μg/ml的PI染色液，避光反應30 min，流式細胞儀檢測各組細胞的周期分布情況。實驗重復3次。

1.2.4 MTT 法檢測細胞增殖能力取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組T24細胞，以每孔4×103/ml的濃度接種于96孔板，每孔 100 μl，常規培養 24 h，每孔加入 5 mg/ml的MTT溶液20 μl，培養4 h后加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）100 μl，振蕩混勻 10 min，酶標儀測定570 nm處的吸光度（A）值。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況取對照組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞，預冷后 PBS 洗滌細胞，400 μl的 1×binding buffer重懸細胞（約含有1×106個細胞），分別加入5 μl和 10 μl的 Annexin V-FITC/PI溶液，避光孵育 15～20 min，1 h內采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況，檢測前加入 1×binding buffer溶液 300 μl。實驗重復3次。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX 蛋白的相對表達量裂解液提取對照組、NC組、si-FSCN1組、普魯卡因組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞的總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取30 μg的變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，洗膜后采用5%的脫脂奶粉室溫封閉，4℃搖床孵 育 一 抗（1∶1000稀 釋 的 FSCN1、STAT3、p-STAT3、cyclin D1、BAX 及內參 GAPDH 抗體）過夜，洗膜，加入HRP標記的二抗（1∶2000），37℃孵育 1.5 h，電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）液顯色、定影。Quantity軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FSCN1蛋白相對表達量的比較

轉染后，si-FSCN1組T24細胞FSCN1蛋白的相對表達量為（0.09±0.01），明顯低于對照組的（0.36±0.04）和NC組的（0.37±0.04），差異均有統計學意義（t=10.671、10.633，P＜0.01）；且NC組和對照組細胞FSCN1蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 細胞周期分布情況的比較

普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞G0/G1期細胞比例均高于對照組細胞，G2/M期、S期細胞比例均低于對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且普魯卡因+si-FSCN1組細胞G0/G1期細胞比例高于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，G2/M期及S期細胞比例均低于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 4組細胞周期分布情況的比較（±s）

表1 4組細胞周期分布情況的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別G0/G1期G2/M期S期對照組55.06±1.6528.23±0.8516.71±0.42普魯卡因組67.49±1.78a22.33±0.77a10.18±0.35a si-FSCN1組65.35±1.51a23.45±0.81a11.20±0.38a普魯卡因+si-FSCN1組77.21±2.01a b c16.52±0.53a b c6.27±0.27a b c F值81.134123.343431.282 P值0.0000.0000.000

2.3 細胞增殖能力和細胞凋亡率的比較

普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞A值均低于對照組細胞，細胞凋亡率均高于對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且普魯卡因+si-FSCN1組細胞A值低于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，細胞凋亡率高于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 4組細胞增殖能力和細胞凋亡率的比較（±s）

表2 4組細胞增殖能力和細胞凋亡率的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別A值 凋亡率（%）對照組0.84±0.073.46±0.32普魯卡因組0.52±0.05a26.37±2.02a si-FSCN1組0.58±0.05a19.18±1.63a普魯卡因+si-FSCN1組0.31±0.03a b c38.81±3.16a b c F值54.228155.325 P值0.0000.000

2.4 STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白的相對表達量的比較

Western blot檢測結果顯示，普魯卡因組、si-FSCN1組和普魯卡因+si-FSCN1組細胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相對表達量均低于對照組細胞，BAX蛋白的相對表達量均高于對照組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）；普魯卡因+si-FSCN1組細胞p-STAT3、cyclin D1蛋白的相對表達量均低于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，BAX蛋白的相對表達量均高于普魯卡因組和si-FSCN1組細胞，差異均有統計學意義（P＜0.05）。4組細胞STAT3蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

表3 4組細胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相對表達量的比較（±s）

表3 4組細胞STAT3、p-STAT3、cyclin D1和BAX蛋白相對表達量的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與普魯卡因組比較，P<0.05；c與si-FSCN1組比較，P<0.05

組別STAT3p-STAT3cyclin D1BAX對照組0.77±0.070.20±0.020.49±0.050.11±0.01普魯卡因組0.75±0.070.09±0.01a0.17±0.02a0.16±0.02a si-FSCN1組0.75±0.070.11±0.01a0.24±0.03a b0.16±0.02a普魯卡因+si-0.76±0.070.04±0.01a b c0.07±0.01a b c0.41±0.04a b c FSCN1組F值0.05690.36399.683109.741 P值0.9820.0000.0000.000

3 討論

FSCN1是一種細胞骨架蛋白，可與F肌動蛋白交聯從而調節細胞膜片狀偽足、絲狀偽足及微棘的形成，影響腫瘤細胞的侵襲和遷移[12]。研究顯示，除肺癌和肝癌外，FSCN1蛋白在大部分上皮腫瘤組織中表達水平較高，且明顯高于正常組織[13]，表明FSCN1在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。但也有研究表明，抑制FSCN1的表達可抑制卵巢癌細胞的增殖能力[14]。研究顯示，FSCN1在膀胱癌患者膀胱組織中表達水平較高，且與腫瘤細胞侵襲和轉移密切相關[15]，抑制FSCN1的表達可抑制膀胱癌細胞的增殖能力[7]。因此，本研究旨在探討抑制FSCN1的表達對膀胱癌細胞的影響。

RNA干擾是一種新的基因阻斷技術，可在轉錄后抑制相關基因的表達水平，因其對相關基因的抑制作用與基因敲除類似，且具有高特異性和高效性的優勢，目前已廣泛地應用于基因功能研究和腫瘤的治療中[16-17]。本研究結果顯示，si-FSCN1組細胞A值降低，凋亡率升高，且細胞被阻滯在G0/G1期。普魯卡因是一種常用的局部麻醉藥物，臨床主要用于支氣管哮喘和老年慢性病等的治療，研究發現，普魯卡因可用于抗腫瘤治療，可抑制包括膀胱癌在內的多種惡性腫瘤細胞的生長[8]。抑制FSCN1基因的表達聯合普魯卡因治療膀胱癌成為臨床研究的熱點。本研究結果發現，普魯卡因聯合FSCN1siRNA抑制膀胱癌細胞增殖、誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期的作用比FSCN1siRNA或普魯卡因單獨使用的效果更加明顯，表明FSCN1siRNA聯合普魯卡因治療膀胱癌可產生協同作用。

STAT3是是一類重要的轉錄因子，在多種惡性腫瘤細胞和腫瘤組織中表達異常，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移、免疫逃逸等行為密切相關，STAT3的持續激活可引起細胞的增殖異常和惡性轉化[18-20]。但STAT3并不直接作用于腫瘤細胞，而是通過對一些與腫瘤增殖、凋亡等相關因子表達的調控影響腫瘤的發生發展。cyclin D1是STAT3信號下游的靶基因，作為細胞周期核心因子，可使腫瘤細胞由G1期向S期轉變，在包括膀胱癌在內的多種惡性腫瘤中異常表達，具有促進腫瘤細胞增殖的作用[21-22]。BAX是B細胞淋巴瘤/白血病-2家族成員，具有促進細胞凋亡的作用，可調控多種惡性腫瘤細胞的凋亡過程[23-24]。本研究結果顯示，FSCN1siRNA或普魯卡因均可抑制p-STAT3、cyclin D1蛋白的表達，上調BAX蛋白的表達，且二者聯合的調控作用更明顯，表明FSCN1siRNA和普魯卡因均可通過下調STAT3信號通路的表達抑制膀胱癌細胞的生長。

綜上所述，普魯卡因或FSCN1均可抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，將腫瘤細胞阻滯于G0/G1期，且可能通過STAT3信號通路發揮協同作用。