揚州鹽水鵝風味圖譜的建立

陸煬, 顏云蕎, 崔桂友*

(1.揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127；2.無錫國通環境檢測技術有限公司，江蘇 無錫 214101)

食品指紋圖譜從整體上研究食品物質體系，是一種較為復雜的技術。其特點是利用指紋圖譜的特異性有效鑒別食品產地或真假，主要用于評價樣品的真實性、優良性和穩定性。氣相色譜-質譜法的指紋圖譜是建立在用氣體作為流動相色譜分離并定量與用質譜定性相聯用的分析方法。通過對質譜庫的比對分析及指紋圖譜相似度的計算得出重現性好、高效、有代表的樣品指紋圖譜。而指紋圖譜相似度的計算是基于對大量色譜數據進行化學計量學方法處理的。化學計量學是一門新興的化學分支科學，運用數學、統計學、計算機科學以及其他相關學科的理論和方法，優化化學量測過程，并通過解析化學測量數據以最大限度地獲取化學及相關信息[1]。所以，可以對大量常規相似的數據高效地辨識，從而進行定性、定量和質量控制，解決了人工感官檢測所引起的抽象和主觀問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

揚州鹽水鵝:購于揚州市邗江區黃玨鎮某攤位。采樣時間上午11∶00，鵝肉稱重后由攤主切成符合食用要求的薄塊，并裝入聚乙烯塑料袋中(攤主提供)。另取一袋倒入適量鹵汁備檢。摻兌實驗所用摻兌樣為風鵝，購于揚州歐尚超市，廠家為揚州市霧中花食品工貿有限公司。

1.2 試驗設備

料理機 山東九陽小家電有限公司；SPEM手動進樣手柄、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭、75 μm CAR/PDMS萃取頭、50/30 μm DVB/CAR-PDMS萃取頭 上海安譜科學儀器有限公司；DSQ Ⅱ型氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 美國賽默飛世爾科技公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海申生生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

試驗材料為揚州鹽水鵝(8個批次，編號為1～8)。鵝肉用料理機絞碎，取4 g放入15 mL樣品萃取瓶中，蓋上蓋子，冷藏待用。鹵水取定量直接分裝至15 mL樣品萃取瓶中，蓋上蓋子，冷藏待用。

將萃取頭在氣相色譜的進樣口老化，老化溫度為250 ℃，載氣體積流量為0.8 mL/min，分流比為50∶1，老化時間為2 h。

利用手動進樣手柄將固相微萃取器的萃取頭插入到樣品瓶中，恒溫45 ℃，推出萃取頭。吸附40 min，隨后拔出于氣相色譜儀進樣。250 ℃解析2 min，同時啟動儀器采集數據。

1.3.2 儀器測定條件[2]

氣相色譜條件：毛細血管柱為DB-5MS柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速為0.8 mL/min，不分流，恒壓35 kPa，進樣溫度250 ℃，接口溫度250 ℃，起始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至130 ℃，無保留；再以8 ℃/min升溫至200 ℃，無保留；再以12 ℃/min升溫至250 ℃，保留15 min。

質譜條件：EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，質譜質量掃描范圍33～500 amu。

1.3.3 摻兌實驗

取部分待測9號鹽水鵝樣品進行摻兌實驗，分別摻比風鵝樣品0%、25%、50%、75%(質量分數)，編號為C1、C2、C3、C4。

1.3.4 定性方法

定性：化合物經計算機檢索同時與NIST Library(107 k compounds)和Wiley Library(320 k compounds)相匹配。僅報道匹配度和純度大于800(最大值1000)的鑒定結果。

2 結果與討論

2.1 色譜峰的匹配

本試驗選用內標法對揚州鹽水鵝中的風味物質進行定量分析，在樣品中添加2-乙酰基吡啶(GR級)，通過組分與內標峰的面積比，對組分進行定量，該方法減少了手動進樣誤差對定量結果的影響。在相同試驗條件下測定2-乙酰基吡啶，其保留時間約為11.98 min，其出峰位置、峰形、分離度和穩定性均比較好；揚州鹽水鵝風味物質主要是碳氫氧成分，所以內標物2-乙酰基吡啶與分析目標成分有類似的化學性質，對風味組分定量效果較好；且樣品在該處沒有色譜峰，可以作為試驗的內標參考峰。以此參考峰求出其他所有色譜峰的相對保留時間α。以2-乙酰基吡啶出峰時間為標準，對各峰進行定位匹配。

計算公式：α=tri/trs。

式中：tri為待測峰的絕對保留時間；trs為內標參考峰的絕對保留時間。

2.2 指紋圖譜的建立與分析

對1～8號樣品進行測定，從中選取了9個共有峰作為可以構成揚州鹽水鵝風味指紋圖譜的特征指紋峰。特征指紋峰的峰面積占總峰面積的35%以上，值得注意的是部分色譜圖中乙醇含量很高，相對峰面積超過50%，這可能是由于揚州鹽水鵝在制作過程中添加的料酒量不同導致檢測數值不同，所以乙醇不能作為共有峰成為特征指紋峰。以數字編號的峰為揚州鹽水鵝的指紋峰見圖1，S為內標物2-乙酰基吡啶所出峰，并據此求出每一個標樣特征峰的相對峰面積Sr值。以2-乙酰基吡啶的峰面積為標準，對各峰進行定量匹配。

圖1 揚州鹽水鵝標準樣品指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of standard samples of Yangzhou salted goose

注：1～9號峰分別為己醛、C16H18NO2、己酸乙烯基酯、辛醛、芳樟醇、壬醛、癸醛、4-烯丙基苯甲醚、C10H12O2，S為2-乙酰基吡啶所出峰。

計算公式：Sr=Ai/As×100%。式中：Ai為特征峰的面積；As為內標參考峰的面積。

將樣品中的各組分的相對保留值α按從小到大的順序排列，找出共有特征峰的α值從小到大排列，得到表1。計算可得共有特征峰對應的Sr值，見表2。由此可建立起揚州鹽水鵝風味指紋圖譜，見圖1。

表1 1～8號樣品指紋圖譜中α值Table 1 The α values in fingerprint of 1～8 samples

表2 1～8號樣品指紋圖譜中Sr值Table 2 The Sr values in fingerprint of 1～8 samples

由表1和表2可知，揚州鹽水鵝的主要風味成分為碳氫氧成分，其以醛類居多，醛類物質閾值低且在醬腌肉中含量較高，是醬腌肉風味形成極其重要的一類化合物。肉品揮發性風味成分中的醛來源于脂肪氧化，其中辛醛(油脂清新氣息)和壬醛(脂肪香氣)是油酸氧化的產物[3]，己醛(清新香草香氣)是亞油酸的主要氧化產物[4]，其次還有醇類及雜環化合物類。含N的雜環化合物是對肉類風味起主要作用的化合物之一，而醚類化合物也是重要的風味物質，特別是含有苯環的醚，大多數具有強烈而愉快的香氣。本實驗檢測的4-烯丙基苯甲醚很可能與所加香辛料八角茴香、大茴香等有關。

2.3 精確性實驗

對3號標樣連續進行10次，按1.3.1操作及1.3.2儀器測定條件進行分析，其特征峰的相對保留時間α值和特征峰的相對峰面積Sr值見表3和表4。

表3 精確性實驗特征峰的相對保留時間α值Table 3 The relative retention time α values of characteristic peaks in accuracy experiments

續 表

表4 精確性實驗特征峰的相對峰面積Sr值Table 4 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in accuracy experiments

由表3和表4可知，揚州鹽水鵝風味特征峰的相對保留時間α值的RSD均小于2%；且特征峰的相對峰面積Sr值的RSD也比較小，均低于3.5%。進一步表明頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法檢測精確性較高，與指紋圖譜檢測要求相符。

2.4 重復性實驗

按1.3.1操作及1.3.2儀器測定條件進行分析，取1～5號樣品分5次進行試驗，共計5 d，其特征峰的相對保留時間α值和特征峰的相對峰面積Sr值見表5和表6。

表5 重復性實驗特征峰的相對保留時間α值Table 5 The relative retention time α values of characteristic peaks in repetitive experiments

表6 重復性實驗特征峰的相對峰面積Sr值Table 6 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in repetitive experiments

由表5可知，揚州鹽水鵝風味特征峰的相對保留時間α值的RSD值較小，均小于2%，說明頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法檢測特征峰的相對保留時間α值有較好的重復性。由表6可知，揚州鹽水鵝風味特征峰的相對峰面積Sr值的RSD值在1%～23%的范圍內，表明頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法檢測特征峰的相對峰面積Sr值的穩定性一般，這可能與頂空固相微萃取處理方法有關。

2.5 穩定性實驗

取4號樣品，分別在制備后1，4，8，12，24，48 h進樣，其特征峰相對保留時間α值和相對峰面積的Sr值見表7和表8。

表7 穩定性實驗特征峰的相對保留時間α值Table 7 The relative retention time α values of characteristic peaks in stability experiments

表8 穩定性實驗特征峰的相對峰面積Sr值Table 8 The relative peak area Sr values of characteristic peaks in stability experiments

由表7和表8可知，揚州鹽水鵝的特征峰的相對保留時間α值的RSD值均小于2.5%，而相對峰面積Sr值的RSD值也比較小，均小于8.5%。表明頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜法檢測揚州鹽水鵝風味揮發性成分在48 h內穩定性較好，與指紋圖譜檢測要求相符。

2.6 色譜指紋圖譜相似度計算與分析

指紋圖譜的特異性，能有效鑒別食品樣品的真偽或產地，評價樣品的真實性、優良性和穩定性。通過制定指紋圖譜，使特征峰的含量和比例可以達到控制食品質量和確保食品質量相對穩定的目的。而指紋圖譜相似度正是一種評價指紋圖譜穩定性與均一性的重要指標。指紋圖譜相似度主要是分析指紋圖譜，強調準確的辨識而非精密的計算。宏觀上對特征進行分析，重點在于辨認圖譜整體面貌，而不是追求細枝末節[5]。

目前可查閱的關于研究指紋圖譜相似度的文獻較少，洪筱坤等人[6]研究指出色譜指紋圖譜的相似度需要從整體上考慮，單純引入N強峰、重疊率等量化數據分析圖譜間的相似程度，難以全面判斷指紋圖譜質量。倪力軍等人[7]用相關系數和距離系數僅對紅外指紋圖譜間相似度進行量化評價和比較，其判斷過程和結果也存在一定的主觀性。

相似度的評價方法主要包括以下三種類型：一是利用指紋圖譜間的差異性評價，如距離系數法；二是利用指紋圖譜間的相似性評價，如夾角余弦法；三是利用相似性與差異性的結合來評價，如改進的Nei系數法。改進的Nei綜合了色譜指紋圖譜的總色譜峰、保留時間、峰面積(或峰高)等多重信息，能夠比較全面地判斷指紋圖譜的綜合信息，所以又稱為綜合信息指數[8]。但是由于本試驗采取的前處理方法為頂空固相微萃取，由于手動操作的原因，樣品風味成分的保留時間有所偏差，導致綜合信息指數波動較大，無法準確全面地判斷揚州鹽水鵝的風味指紋圖譜。所以，本文主要選擇前兩種評價方法綜合評價揚州鹽水鵝指紋圖譜相似度及差異性。

2.6.1 歐氏距離[9]

歐氏距離是距離測度中使用最廣泛的一種，公式為：

式中：Xik代表第i個樣品第k個特征變量，Xrk代表共有模式均值向量第k 個特征變量(k=1，2，3……m)。歐氏距離在量上反映的是指紋圖譜間的距離和化學成分含量的差異，側重于特征變量值的大小親疏程度的相似性。但是該系數沒有考慮到各指紋峰的相關性和方差的差異性問題，所以存在一定的局限性。

2.6.2 夾角余弦系數[10]

夾角余弦系數是指紋圖譜特征變量在變化模式上的相似性測度，源于幾何學中相似形和多維空間向量夾角的理論，其公式為：

式中：Xik代表第i個樣品第k個特征變量, Xrk代表共有模式均值向量第k個特征變量(k=1，2，3……m)。夾角余弦系數從質上判斷樣品與標準圖譜之間的相似性，從而識別化學組成在含量比例上的相似性。

2.6.3 皮爾遜相關系數

在指紋圖譜中以相關系數測度的相似度為：

2.6.4 綜合評價

表9 1～8號揚州鹽水鵝樣品的相似度Table 9 Similarity of Yangzhou salted goose 1～8 samples %

由表9可知，8個批次的揚州鹽水鵝樣品的風味指紋圖譜相似度較高。樣品的歐式距離范圍在3.88%～7.10%，夾角余弦值99.98%以上，相關系數值大于93.88%。有研究表明，歐式距離可以比較好地檢測各指紋圖譜間譜峰總面積的波動情況[11]。而相關系數或者夾角余弦對檢測色譜峰比值的差異性靈敏度較高。以上評價指標都可以用來評價揚州鹽水鵝的風味質量。

2.6.5 待測樣品與摻兌樣品的判定

以上實驗是根據8個批次的揚州鹽水鵝標準品建立指紋圖譜，現對9號樣品分析。對待測樣品按1.3.3操作及以上3種算法計算相似度，結果見表10。

表10 摻兌實驗結果Table 10 The results of blending experiment

由表10可知，9號樣品在不含摻兌的情況下，各項指標包括歐式距離、夾角余弦和相關系數都在標準指紋圖譜的相似度判定的標準范圍之內。由此判斷該待測樣品合格。摻兌后樣品的各個相似度的變化都較為明顯，隨著摻兌含量的升高，樣品的相似度逐漸變小，說明產品質量發生很大波動。綜上，指紋圖譜技術對揚州鹽水鵝的風味評價具有重要意義，可以有效監控揚州鹽水鵝的質量。

3 結論

本試驗主要探究了揚州鹽水鵝指紋圖譜的建立及指紋圖譜相似度的計算。通過對8個批次的揚州鹽水鵝進行檢測分析，利用歐式距離、夾角余弦法及相關系數法等化學計量方法進行相似度的計，算確定了以9種特征風味物質為基礎的指紋圖譜。由此構建的指紋圖譜有較強的特征性及唯一性，既能起到鑒別真偽的效果，又能起到監控質量的穩定性。缺點是由于本試驗的前處理方法是頂空固相微萃取，處理方法雖簡單方便，但是手動進樣會影響風味成分的保留時間，圖譜沒有溶劑進樣穩定。所以今后的研究重點是尋找更適合的實驗方法，將指紋圖譜的所有特征信息有機地結合起來，建立一個全面的揚州鹽水鵝指紋圖譜，為評定揚州鹽水鵝的風味品質提供新的判斷思路，改變傳統的依靠感官評價的單一方法。