柑橘皮發酵汁抗氧化活性和揮發性風味物質分析

付彬，沈婉瑩，周夢舟，吳茜，徐寧

(湖北工業大學生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068)

柑橘是世界第一大水果[1]，根據國家統計局最新數據顯示，2017年全國柑桔產量約為3817萬噸，湖北省柑橘產量居第四位，達466萬噸，柑橘在加工過程中約產生20%～50%的皮渣，然而皮渣的利用率卻不足10%。傳統加工業將這些副產物填埋處理或生產加工成動物飼料[2，3]。皮渣極易霉變發臭，填埋處理會對環境造成嚴重污染，而加工飼料通常需干燥處理，耗費大量的能源[4]。

柑橘皮中富含精油、色素、纖維素、果膠、木質素、黃酮類化合物等，具有抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、治療腸道疾病、維持血管滲透壓、降低血管脆性等作用[5]。

柑橘皮渣開發利用的一個主要途徑是圍繞其所含成分的提取而展開的，另一個主要途徑是利用微生物發酵生產果醋、乳酸飲料、高蛋白飼料和栽培食用菌。運用生物技術對其進行轉化，將各種優良的微生物菌種運用到柑橘皮的綜合利用中，將是解決柑橘皮渣利用的根本出路[6，7]。本實驗采用米曲霉和黑曲霉兩種曲霉分別發酵柑橘皮，獲得柑橘皮發酵汁，并研究了其抗氧化活性和揮發性風味物質，為探索柑橘皮微生物發酵產品的功能營養提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS3.951(滬釀3.042)、黑曲霉(AspergillusnigerHG-35)：以上菌種均保藏于湖北工業大學湖北省食品發酵工程技術研究中心；溫州蜜柑(Citrusunshiu)：湖北土老憨生態農業股份有限公司提供。福林酚、DPPH、TPTZ等試劑：購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

WFJ2000紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器設備有限公司；AB-50電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫用核子儀器廠；GC-MS 5975-7890A氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

接種 18%鹽水

↓ ↓

柑橘皮→蒸煮、滅菌→冷卻→添加面粉→混合均勻→制曲→成曲→發酵→成品。

柑橘皮清潔處理后,于115 ℃蒸壓20 min,冷卻后拌入面粉(橘皮∶面粉為4∶1)并接入米曲霉0.5%，拌勻。制曲32 ℃培養40 h后將曲料裝于發酵罐中，并向發酵罐中注入2倍質量的18%鹽水，置于35 ℃恒溫培養箱發酵。

1.3.2 總黃酮的測定

采用比色法進行測定[8]。吸取適量經稀釋后的柑橘皮發酵汁，加入0.3 mL 亞硝酸鈉溶液(5%，W/V)反應5 min，之后加入0.3 mL硝酸鋁溶液(10%，W/V)，充分混勻后靜置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 氫氧化鈉，之后定容至10 mL。在510 nm處測定吸光值。選取0，0.1，0.2，0.3， 0.4，0.5，0.6 mg/mL的蘆丁作為標準品繪制標準曲線。每毫升柑橘皮發酵汁中總黃酮含量用蘆丁當量RE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.3 總多酚的測定

采用福林酚方法[9]。吸取適量經稀釋后的柑橘皮發酵汁與5 mL稀釋的福林酚溶液(10%，V/V)混合，搖勻后加入2 mL碳酸鈉溶液(15%，W/V)，用蒸餾水補充至10 mL，充分搖勻，在黑暗條件下室溫顯色反應1 h，最后在760 nm處測定吸光值。選取0，10，20，40，60，80 μg/mL的沒食子酸作為標準品制作標準曲線。每1 mL柑橘皮發酵汁中總多酚含量以沒食子酸當量GAE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考Hsiao等人的試驗方法測定DPPH自由基的清除能力。具體方法如下：取0.2 mL稀釋適當倍數的發酵汁，加入3.8 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，充分搖勻，黑暗條件下靜置30 min，然后使用紫外可見光分光光度計測定各樣品在517 nm處的吸光值，調零為0.2 mL去離子水和3.8 mL乙醇，對照為0.2 mL稀釋適當倍數的發酵汁和3.8 mL乙醇，空白為0.2 mL去離子水和3.8 mL DPPH溶液。選取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μmol/L的水溶性維生素E作為標準品繪制標準曲線。每毫升發酵汁中DPPH自由基清除能力用水溶性維生素E當量μmolTE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.4.2 亞鐵離子還原能力的測定

亞鐵離子還原能力(FRAP)參考Granato等的方法[10]，具體方法如下：精確吸取100 μL稀釋樣品，在37 ℃下預熱2 min，同樣加入已在37 ℃下預熱的FRAP工作液(300 mmol/L pH 3.6的乙酸鈉緩沖液∶10 mmol/L TPTZ∶20 mmol/L六水合氯化鐵為10∶1∶1 (V/V/V) 3 mL，再加入300 μL去離子水，然后混勻反應4 min，用紫外可見分光光度計測定樣品在593 nm處的吸光值。空白試劑調零。選取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L的七水合硫酸亞鐵來繪制標準曲線。每毫升發酵汁中FRAP用亞鐵離子當量μmolFE/mL表示，重復3次實驗，取平均值。

1.3.5 揮發性風味物質的測定

揮發性風味物質的測定參照康明麗等的方法[11]。

樣品處理：均勻取樣品9 mL于25 mL螺旋進樣瓶中, 加入3 g 氯化鈉, 用聚四氟乙烯隔墊密封；攪拌平衡30 min,平衡溫度為40 ℃；平衡后將SPME纖維萃取頭經隔墊插入進樣瓶，插入深度為1 cm，推出纖維頭，頂空吸附30 min；取出萃取頭插入GC進樣口，推出纖維頭，解吸5 min后進行GC-MS分析。

GC條件：HP-5MS色譜分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(1.0 mL/min)；分流比為5∶1；升溫程序：起始柱溫40 ℃保持 2 min，以5 ℃/min的速率升到120 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min的速率升至220 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子轟擊能量為70 eV；離子掃描范圍為33～350 m/z，掃描速度為3.00 scans/s，離子源溫度為250 ℃。

2 結果與分析

2.1 總黃酮與總多酚含量

2.1.1 總黃酮含量

黃酮類化合物是一類存在于自然界并具有2-苯基色原酮結構的化合物[12]。柑橘皮渣中含有大量的黃酮類化合物。黃酮具有清除自由基、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤等功能[13-15]。黃酮類化合物在醫藥、食品等行業具有廣闊的應用前景。

柑橘果皮中黃酮類化合物的種類與總含量高于果肉[16]。接種不同曲霉得到的柑橘皮發酵汁中總黃酮含量見圖1。

圖1 柑橘皮發酵汁中總黃酮含量Fig.1 Content of total flavonoids in citrus peel fermented juice

由圖1可知，對照組、接種黑曲霉和米曲霉后柑橘皮發酵汁的總黃酮含量分別為57.54，74.43，62.83 μgRE/mL。接種黑曲霉的柑橘發酵汁中總黃酮含量最高，總黃酮含量比對照組增加了29.34%。接種米曲酶后得到的發酵汁中總黃酮含量比對照組增加了9.19%。

2.1.2 總多酚含量

柑橘中植物化學素種類繁多，特別是酚類物質含量豐富，包括酚酸和類黃酮兩類植物多酚，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤等多種活性功能[17]。接種不同曲霉獲得的柑橘皮發酵汁總多酚含量見圖2。

與對照組相比，接種黑曲霉和米曲霉發酵明顯增加了總多酚含量，含量分別為2.80，5.94 mgGAE/mL，分別提高了49.39%、217.02%。接種米曲霉的發酵汁中總多酚含量約為接種黑曲霉的2倍。

圖2 柑橘皮發酵汁中總多酚含量Fig.2 Content of total polyphenols in citrus peel fermented juice

2.2 抗氧化活性

自由基是引起癌癥、衰老、心血管等退變性疾病的罪惡之源。自由基在體內可直接或間接地發揮強氧化劑作用而與機體內核酸、核蛋白和脂肪酸相結合, 轉變成氧化物或過氧化物, 使之喪失活性或變性, 細胞功能發生障礙, 引起機體逐漸衰老或病變[18-20]。Sadik等[21]的研究表明黃酮類化合物具有清除自由基和抗氧化活性的功能。接種不同曲霉獲得的柑橘發酵汁中抗氧化活性見圖3。

圖3 柑橘皮發酵汁中抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of citrus peel fermented juice

FRAP法和DPPH法測得的抗氧化活性變化趨勢相同。接種曲霉后柑橘發酵汁的抗氧化活性明顯增強。接種黑曲霉的發酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性分別為4.163 μmolTE/mL、8.044 μmolFE/mL，比對照組分別提高了10.19%、38.34%。接種米曲霉的發酵汁DPPH·清除能力、FRAP活性高于黑曲霉發酵，分別為6.257 μmolTE/mL、12.016 μmolFE/mL，比對照組分別提高了65.65%、106.64%。

2.3 揮發性風味物質分析

對發酵第50天的柑橘皮發酵汁中的揮發性風味物質進行分析(見表1)，從柑橘皮發酵汁中共鑒定出66種揮發性物質，對照組、接種黑曲霉和米曲霉制得的柑橘皮發酵汁分別鑒定出29，49，44種揮發性物質,接種曲霉后可明顯增加揮發性物質的種類，其中包括烯烴類、醇類、醛類、酮類、酚類、酯類、芳香烴類以及其他化合物。

表1 柑橘皮發酵汁中揮發性物質成分及相對含量Table 1 Volatile compounds and relative content in citrus peel fermented juice

續 表

注：“—”表示未檢測出。

柑橘皮發酵汁中揮發性物質主要以烯烴類化合物和醇類化合物為主。3種發酵汁中均檢測出蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、杜松烯、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、芳樟醇、(-)-4-萜品醇、松油醇、2-環己烯-1-醇、香茅醇、乙酸香茅酯、乙酸橙花酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、香芹酮、對乙烯基愈瘡木酚、呋喃甲醛、苯甲醛17種揮發性成分。其中包括4種烯烴類物質、6種醇類物質、3種酯類物質、1種酮類物質、1種酚類物質和2種醛類物質。蒎烯、月桂烯、D-檸檬烯、羅勒烯、α-石竹烯、杜松烯、芳樟醇、松油醇、香茅醇、乙酸香葉酯、香芹酮11種柑橘中主要的香氣化合物在接種黑曲霉和接種米曲霉的柑橘發酵汁中均被檢測出來，其相對含量分別為77.2%、90.23%。說明接種黑曲霉和接種米曲霉的發酵汁中的揮發性成分與柑橘中主要香氣成分有部分相同，但是含量有差別。

烯烴類化合物相對含量均達到70%以上，D-檸檬烯含量最高，其中接種米曲霉的發酵汁中D-檸檬烯相對含量高達77.09%。D-檸檬烯對光和熱均不穩定, 易被空氣中的氧氣氧化成有異味的香芹酮[22]。柑橘鮮汁和加工汁儲藏60 d后，其中檸檬烯的含量都減少47%[23]。利用橘皮發酵較好地保存了橘皮中的檸檬烯。同時，接種黑曲霉后，柑橘皮在自體酶和黑曲霉產酶條件下發酵催化，將D-檸檬烯轉化成癸醛、芳樟醇和α-萜烯醇(香茅醇、金合歡醇、4-萜烯醇等), 從而明顯提高了柑橘皮發酵汁的香氣品質[24]，使其具有獨特的甜香味、松油香味、丁香味、玫瑰香味以及薄荷香味。

接種黑曲霉和接種米曲霉后相比對照組都新增的揮發性風味物質有：羅勒烯、α-萜品烯、α-蒎烯、β-欖香烯、1-石竹烯、(+)-香橙烯、α-石竹烯、4，7-甲基丙烯、α-法尼烯、(-)-g-蓽澄茄烯、苯乙醇、紫蘇醇、乙酸香葉酯、4-乙基愈創木酚、蓽澄茄油萜、異亮氨酸16種，可見接種黑曲霉和米曲霉可明顯增加柑橘皮發酵汁中揮發性風味物質的產生。其中，接種黑曲霉的柑橘皮發酵汁中相較對照組和接種米曲霉組增加了2-蒈烯、別羅勒烯、2-呋喃甲醇等15種揮發性物質。接種黑曲霉的柑橘皮發酵汁中風味物質的種類豐富，其醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物和酚類化合物種類明顯高于其他兩組，且相對含量高。

3 總結

本研究利用新鮮柑橘皮、面粉等為主輔原料進行微生物發酵，設置了對照組、接種黑曲霉、接種米曲霉3組實驗，得出接種米曲霉后可明顯提高柑橘皮發酵汁的抗氧化活性，其DPPH·清除能力提高了65.65%，FRAP活性提高了106.64%，均是接種黑曲霉的柑橘發酵汁的1.5倍。檢測出揮發性風味物質數量分別為29，49，44種，以烯烴類物質為主，其次是醇類物質。接種曲霉可明顯增加揮發性風味物質的種類，明顯提高了柑橘皮發酵汁的香氣品質。檢測出接種黑曲霉和米曲霉的發酵汁中揮發性風味物質數量略有差異，但種類和相對含量有明顯區別。