板栗殼原花青素穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)分析及體外消化

周浩，涂芬，付欣，鐘清，祝欣然，蘇云霞，楊芳*

(1.武漢工程大學 環(huán)境生態(tài)與生物工程學院，武漢 430205；2.武漢工程大學 化工與制藥學院，武漢 430205)

板栗(CastaneamollissimaBlume)屬殼斗科栗屬堅果類植物[1]，在世界范圍內(nèi)被作為重要的農(nóng)作物之一。板栗深加工過程中產(chǎn)生大量的板栗殼仍以燃燒和自然腐爛等方式處理[2]，這樣既造成了資源浪費也不利于環(huán)保。據(jù)資料顯示，板栗殼中含有色素、有機酸、多酚類、多糖(或苷類)和鞣質(zhì)等化學成分[3]。板栗殼的多酚類物質(zhì)主要組分為單寧，而單寧的種類包括很多，其中具有抗氧化活性結(jié)構(gòu)的主要成分為鞣花單寧和原花青素。人體內(nèi)的自由基過剩會引起多種疾病[4]，包括心血管疾病、白內(nèi)障、阿爾茨海默氏癥等，但是體內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)不足以防御細胞損傷，所以從食物資源中尋找天然抗氧化劑已成為研究熱點。有研究表明板栗殼原花青素具有抵御自由基、抑菌殺菌等作用，可以廣泛應用于食品及調(diào)味品行業(yè)[5]。丁培峰研究了茶多酚在醬油中的防腐效果，結(jié)果顯示，茶多酚與納他霉素復配使用后與山梨酸鉀具有等同的防腐效果，且安全性大大提升[6]。同時，茶多酚具有一定的保健功效，可提高醬油的營養(yǎng)價值和保健功能。

多酚類物質(zhì)雖然具有多種生理活性和延長調(diào)味品保質(zhì)期的效果，但是外界條件也會影響其穩(wěn)定性，從而降低它的生理活性，且人體中的胃液及腸道消化液也會對多酚的活性產(chǎn)生影響[7]。例如，提取自姜黃根莖的多酚類化合物姜黃素的藥理作用廣泛，毒性小，并且長期以來作為調(diào)味品和食品添加劑在國內(nèi)外廣泛應用，但是，由于其生物利用度低顯著影響其應用價值[8]。目前對板栗殼原花青素的研究主要在抗氧化性及提取優(yōu)化等方面，對其作為調(diào)味品功能性添加劑的開發(fā)以及其在人體中的消化吸收研究較少。因此，本實驗探究影響板栗殼粗提物中原花青素穩(wěn)定性的因素，利用HPLC-MS研究其種類并進行結(jié)構(gòu)表征，同時通過人體體外消化模型研究其消化情況，為板栗殼中天然抗氧化劑的開發(fā)及其在食品和調(diào)味品方面的應用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗：取自山東祁蒙山。

香草醛、α-淀粉酶、膽汁提取物、胰蛋白酶、胃蛋白酶：國藥集團化學試劑有限公司；標準品表兒茶素、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TG16-WS離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；UV-1800紫外可見光分光光度計 上海美諾達儀器有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Agilent 1100 LC-MSD/TOF高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 板栗殼粗提物提取制備

將板栗殼洗凈晾干，粉碎過40目篩得到板栗殼粉末。參考蘇云霞等研究得到的最佳提取工藝，取適量板栗殼粉末加入70%乙醇水溶液，使料液比為1∶15(g/mL)，在65 ℃的條件下提取90 min，再將提取液進行真空抽濾，濾液在40 ℃下真空濃縮，再次冷凍干燥，低溫保存?zhèn)溆肹9]。

1.3.2 板栗殼粗提物中原花青素穩(wěn)定性影響因素研究

1.3.2.1 板栗殼原花青素溶液的制備

稱取板栗殼粗提物0.1 g，用蒸餾水定容至100 mL，研究光照、溫度、金屬離子和pH對原花青素的影響。

1.3.2.2 光照對板栗殼原花青素的影響

取10 mL板栗殼原花青素溶液3份，分別置于室溫光照、室溫避光和低溫避光的條件下，放置4 d，每隔1 d取樣測定樣品溶液中原花青素含量(以保存率表示)；原花青素保存率=樣品待測時原花青素含量/樣品初始原花青素含量×100%。原花青素的測定方法采用硫酸-香草醛比色法[10,11]。

1.3.2.3 溫度對板栗殼原花青素的影響

取10 mL板栗殼原花青素溶液6份，分別在40,50,60,70,80,90 ℃條件下恒溫水浴2 h，原花青素含量測定方法同上。

1.3.2.4 pH對板栗殼原花青素的影響

取10 mL板栗殼原花青素溶液14份，用HCl和NaOH溶液配制成pH為1～14的溶液，將原花青素樣品與10 mL pH為1～14的溶液混合，密封靜置6 h，原花青素含量測定方法同上。

1.3.2.5 金屬離子對板栗殼原花青素的影響

配制0.02 mol/L含F(xiàn)e3+、Fe2+、Ba2+等金屬離子的溶液待用，再把不同金屬離子溶液與原花青素溶液等體積混合，密封放置一段時間，觀察溶液顏色變化。

1.3.3 板栗殼原花青素結(jié)構(gòu)分析

用高效液相測定沒食子酸、沒食子兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯6種標準品及板栗殼粗提物出峰時間，比較得出板栗殼粗提物中所含物質(zhì)，并對粗提物進行高分辨質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析。

色譜條件[12-14]：色譜柱為DIONEX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇(B)(體積分數(shù)為0.05%)-三氟乙酸(A)，梯度洗脫：0～12 min,A：87%～75%，B：13%～20%；12～23 min，A：75%～20%，B：25%～80%；23～26 min，A：87%，B：13%。流速：0.5 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

質(zhì)譜分析條件[15]：色譜柱為Lichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；質(zhì)譜進樣分流比為1∶1；負離子模式；離子化方式： ESI-；掃描范圍： m/z 50～2000；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：15 L/min；噴霧壓力：40 psi；毛細管電壓：3500 V。

1.3.4 板栗殼原花青素的消化吸收[16]

1.3.4.1 消化體系的制備

胃液環(huán)境配制[17-19]：在250 mL燒杯中加入0.4 g的胃蛋白酶、9 mg/mL的氯化鈉溶液90 mL混勻，再轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)使溶液pH為2～2.3，直至溶液至容量瓶刻度線。

腸道環(huán)境配制：在250 mL燒杯中加入225 mg的胰蛋白酶、225 mg的膽汁提取物、9 mg/mL的氯化鈉溶液90 mL混勻，再轉(zhuǎn)入100 mL的容量瓶中，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)使溶液pH為7～7.2，直至溶液至容量瓶刻度線。

1.3.4.2 模擬胃液消化

設置5組平行試驗和1個空白對照，每組平行實驗條件如下：在50 mL錐形瓶中依次加入中口腔消化液4 mL、胃消化液16 mL，于37 ℃、轉(zhuǎn)速為250 r/min的搖床中震蕩反應2 h，每0.5 h測1次pH值，通過測pH的變化可初步判斷原花青素是否消化；并在反應時間為0.5，1，1.5，2 h各取1 mL消化液，測定原花青素的含量，并計算其消化率；消化率=(1-測得原花青素質(zhì)量/最開始加入原花青素質(zhì)量)×100%。

1.3.4.3 模擬腸道消化

設置5組平行試驗和1個空白對照，每組平行實驗條件如下：量取胃液消化液20 mL，用氫氧化鈉中和到pH為7，終止胃液消化反應；再加入20 mL腸道消化液反應2 h，并在反應時間0.5，1，1.5，2 h各取1 mL消化液測定原花青素的含量，并計算其消化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗殼原花青素穩(wěn)定性影響因素研究

2.1.1 光照對板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響

圖1 光照對原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of proanthocyanidins

由圖1可知，板栗殼原花青素溶液在光照條件下，原花青素的保存率對比另外兩種情況下降速度更快，同時光照條件下溶液顏色易由棕紅色變成淡紅色，而在室溫避光和低溫避光條件下，顏色沒有明顯變化；這與高凝軒等的實驗結(jié)果一致，可能原花青素的結(jié)構(gòu)在光照條件下被破壞，故光照對原花青素的穩(wěn)定性有影響[20]。

2.1.2 溫度對板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響

圖2 溫度對板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of proanthocyanidins

由圖2可知，溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，原花青素的保存率基本不變，即在該溫度范圍內(nèi)，原花青素相對比較穩(wěn)定，降解不大；當溫度高于60 ℃時，板栗殼原花青素保存率不斷下降，高溫可能導致原花青素發(fā)生氧化聚合，則板栗殼原花青素在提取、濃縮、干燥及保存過程中，應使溫度低于60 ℃。

2.1.3 pH對板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響

圖3 pH對板栗殼原花青素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of proanthocyanidins

由圖3可知，當pH在1～7范圍內(nèi)，原花青素保存率變化很小，則此pH值范圍適于原花青素的保存；當pH>7時，隨著pH增大，原花青素保存率不斷下降，且當pH>8時，原花青素溶液顏色發(fā)生變化；根據(jù)報道，原花青素在堿性條件下其結(jié)構(gòu)易發(fā)生降解和差向異構(gòu)化[21]，導致含量下降。即堿性條件下容易造成板栗殼原花青素結(jié)構(gòu)的破壞，使穩(wěn)定性下降。

2.1.4 金屬離子對板栗殼中原花青素穩(wěn)定性的影響

原花青素對金屬離子較敏感，多價金屬離子可以與原花青素的鄰二酚羥基發(fā)生絡合反應，形成五元環(huán)螯合物。板栗殼原花青素在K+、Na+、Al3+、Mg2+條件下沒有發(fā)生變化；在Cr3+、Zn2+、Sn2+、Ca2+條件下產(chǎn)生少量絮狀物，而在Fe3+、Fe2+、Ba2+存在的條件下產(chǎn)生大量黑色絮狀物，這是由于Fe3+、Fe2+、Ba2+與原花青素的鄰位二羥基形成了不溶性的絡合物。故在原花青素樣品保存過程中，應注意避免與Fe3+、Fe2+、Ba2+接觸。

2.2 原花青素結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 原花青素種類鑒定

板栗殼粗提物組分復雜，對比文獻[22-24]報道的原花青素類質(zhì)荷比，選擇合適的分子離子峰進行碰撞誘導解離，根據(jù)二級質(zhì)譜裂解獲得的碎片離子及文獻進一步對比，鑒定出粗提物中原花青素種類有沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素、B型原花青素二聚體，HPLC-MS分析結(jié)果見表1。

表1 板栗殼粗提物原花青素HPLC-MS分析結(jié)果Table 1 Analysis results of proanthocyanidins from crude extracts of chestnut shell by HPLC-MS

2.2.2 沒食子酸二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

沒食子酸的苯環(huán)上含有3個羥基和1個羧基，在ESI-的質(zhì)譜條件下失去1個H離子生成[M-H]-，以m/z 169.2為母離子進行碰撞誘導解離，其主要的裂解碎片離子為m/z 124.7，與文獻[25]的報道一致。分子離子裂解規(guī)律見表2，m/z 124.7為失去一分子羧基所得。

2.2.3 兒茶素二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

兒茶素主要的二級碎片離子有m/z 124.7，178.7，204.7，244.7，與劉國強等報道的結(jié)果吻合[26]。分子離子峰裂解規(guī)律見表2，碎片峰1的m/z 24.7為A環(huán)的1，4開環(huán)裂解得到；m/z 178.7為[M-H]-失去一分子C6H6O2產(chǎn)生的碎片離子峰；m/z 204.7為[M-H]-失去兩分子C2H2O產(chǎn)生； m/z 244.7為[M-H]-失去一分子CO2所得。

2.2.4 沒食子兒茶素二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

經(jīng)HPLC-MS分析后得到的主要二級碎片離子有m/z 286.8，124.9，根據(jù)許文等研究報道確認為沒食子兒茶素，分子離子峰裂解規(guī)律見表2，m/z 286.8為[M-H]-失去一分子水所產(chǎn)生的碎片離子峰；m/z 124.9為A環(huán)的1，4開環(huán)裂解得到[27]。

2.2.5 B型原花青素二聚體二級質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

B型原花青素二聚體是原花青素單體通過C4-C8或C4-C6相連并在C2和C7或者C2和C5之間形成C-O-C鍵的化合物[28]，在ESI-模式下失去1個H得到m/z 576.8，以m/z 576.8為母離子進行碰撞誘導解離，其主要的裂解碎片離子為m/z 288.7，406.8，424.7，450.9，558.9，與楊代曉等報道的結(jié)果一致，故可鑒定為B型原花青素二聚體[29]。分子離子峰裂解規(guī)律見表2，m/z 288.7是分子間斷裂失去1個A-unit聚合單元得到；m/z 406.8是分子離子先發(fā)生RDA反應，再失去一分子水得到；m/z 424.7是由分子離子發(fā)生RDA反應所得；m/z 450.9是由分子離子失去間苯二酚得到；m/z 558.9是分子離子失去一分子水所得。

表2 板栗殼粗提物二級質(zhì)譜中主要碎片離子及裂解規(guī)律Table 2 The main fragment ions and cracking rule in secondary mass spectra of crude extracts from chestnut shell

2.3 板栗殼粗提物中原花青素的消化吸收結(jié)果分析

2.3.1 原花青素在模擬胃液中的消化結(jié)果

板栗殼粗提物在模擬胃液中的消化情況見圖4，原花青素在胃液條件下被分解，消化時間越長，原花青素的含量越低。

圖4 原花青素胃消化結(jié)果Fig.4 Gastric digestion results of proanthocyanidins

由圖4可知，原花青素的最大胃消化率為18.7%。

2.3.2 原花青素在模擬小腸液中的消化結(jié)果

板栗殼粗提物在模擬小腸液中的消化情況見圖5，原花青素的消化率隨時間增加逐漸增大，在1.5～2 h時間內(nèi)，原花青素的消化速率幾乎不變，表明原花青素在模擬小腸中的消化已完全。

圖5 原花青素腸消化結(jié)果Fig.5 Intestinal digestion results of proanthocyanidins

由圖5可知,原花青素的最大腸消化率為20.5%。蔬菜和水果中的多酚主要以可溶性形式存在，而禾谷物中的酚類主要以結(jié)合態(tài)形式存在，結(jié)合態(tài)酚類主要與細胞壁成分共價結(jié)合，但由于細胞壁纖維物質(zhì)難以消化，所以結(jié)合態(tài)酚類在胃及小腸中難以被消化。通常用酸水解糖苷鍵或堿水解醚鍵、酯鍵來提取結(jié)合態(tài)酚類，而乙醇則用來提取可溶性酚類。本實驗中用乙醇來提取板栗殼原花青素，故粗提物中多酚主要以可溶性酚類為主。李俶等研究了幾種多酚化合物體外模擬消化，結(jié)果表明兒茶素、表兒茶素在模擬胃液消化過程中穩(wěn)定性較差，含量分別下降16.6%、6%，而在模擬腸道消化過程中，僅表兒茶素和沒食子酸的含量下降。Tenore等發(fā)現(xiàn)兒茶素在胃腸消化液中含量下降是由于兒茶素對胃腸道的酸堿pH值敏感，腸道堿性環(huán)境和溶解氧引起兒茶素二聚體自氧化[30]。故導致板栗殼原花青素在模擬胃液消化中含量下降的原因可能是兒茶素和表兒茶素被降解，在模擬腸道消化中含量下降的原因可能是表兒茶素、兒茶素、沒食子酸被降解。

3 結(jié)論

綜上所述，光照、溫度、pH及金屬離子均會影響板栗殼原花青素的穩(wěn)定性。當溫度大于60 ℃、pH>7以及金屬離子Fe3+、Fe2+、Ba2+存在的條件下均會破壞板栗殼原花青素的結(jié)構(gòu)。通過體外消化模擬實驗，發(fā)現(xiàn)原花青素在小腸及胃中的消化率達到18.7%和20.5%。利用HPLC-MS對板栗殼粗提物進行結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)分子量及二級質(zhì)譜碎片離子鑒定出粗提物中含有沒食子酸、兒茶素、沒食子兒茶素和B型原花青素二聚體。本課題組前期研究顯示，板栗殼提取物具有顯著的體外抗氧化活性，在本研究基礎上，綜合考慮其在體外的穩(wěn)定性和體內(nèi)消化特性，為將其開發(fā)成既具有抗氧化活性又具有生理功能的調(diào)味品添加劑提供了科學根據(jù)。