葉酸與TSLC1在喉鱗狀細胞癌中的相關性研究

常 浩，李陽陽，馬 民，韓亞靜

喉鱗狀細胞癌(carcinoma of larynx)是耳鼻喉科中最為常見的喉部上皮組織惡性腫瘤之一，以鱗狀細胞癌為最多見，約占90%[1-2]。喉鱗狀細胞癌的發生、發展受環境、生活習慣、內分泌因素、遺傳因素和腫瘤基因改變等多種因素的作用和影響。最近研究表明，葉酸缺乏可能與人類腫瘤的發生有關[3]。TSLC1(tumor suppressor in lung cancer,肺癌腫瘤抑制因子-1)與多種惡性腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移密切相關[4]。但二者之間的相關性，國內外鮮有報道。本研究采用了免疫組化、放射免疫學的方法，探討喉鱗狀細胞癌患者血清中葉酸的含量和癌組織細胞中TSLC1蛋白表達與喉鱗癌病變程度之間的關系。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料觀察組：選取2011年9月至2014年9月河南科技大學第一附屬醫院耳鼻喉科手術切除的喉鱗狀細胞癌組織60例及同一病人的癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣0.5 cm非腫瘤組織)石蠟標本為對照。所有被抽取的患者術前均未經過任何輔助性放、化療，且均為第一次入院病例。所有病例病理診斷明確，臨床資料真實可靠，病理分期按照國際TNM分期標準。對照組：30例健康對照者通過門診常規體檢的方式募集，排除營養性巨幼紅細胞性貧血及其他類型的貧血、上消化道疾病及有手術史、半年內B族維生素使用史等。本研究通過本院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法抽取納入試驗的患者靜脈血，4 ℃離心(3 000 r·min-1，15 min)，分離血清，使用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)定量檢測上述90例患者的血清葉酸水平(試劑盒及所用輔助用品均與儀器配套)，嚴格按照試劑盒操作說明書進行并詳細記錄。血清葉酸診斷采用國際通用的<6.8 mmol·L-1(3 ng·mL-1)標準。組織中TSLC1蛋白檢測：取喉鱗狀細胞癌患者的癌組織和癌旁組織石蠟，每一石蠟塊連續切片3張，厚度4 μm，1張常規HE染色，再次病理證實，另2張常規脫蠟水化，采用枸櫞酸緩沖液煮沸法進行抗原修復后按SP試劑盒(北京康為世紀公司)說明書進行操作。結果判讀：與陰性對照片相比，TSLC1蛋白以細胞質或細胞膜內發現棕黃色顆粒判斷為陽性細胞。采用雙盲法，高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數200個細胞，按照文獻[5]方法統計陽性細胞數：<30%為陰性(-)，≥30%為陽性(+)。

1.3 統計方法使用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學處理，采用卡方檢驗、Fisher’s精確概率法、單因素方差分析、SNK-q檢驗、Spearman相關分析、logistic回歸等統計學分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 喉鱗狀細胞癌組與對照組葉酸含量喉鱗狀細胞癌組血清中葉酸的含量(3.35±1.51) ng·mL-1明顯低于對照組(4.40±1.47) ng·mL-1(t=3.13,P<0.05)。

2.2 TSLCI在喉鱗狀細胞癌及癌旁組織的表達TSLC1蛋白在癌旁組織中的表達率為78%，TSLC1蛋白在癌組織中的表達率為20%，差異有統計學意義(χ2=28.229,P<0.01)。見圖1。

紅箭頭：癌旁組織；藍箭頭：癌組織。圖1 TSLC1蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達(SP，×100)

2.3 葉酸含量與喉鱗狀細胞癌臨床特征用單因素方差分析比較血清中葉酸濃度在喉鱗狀細胞癌各個不同臨床特征之間的水平：葉酸的表達水平與喉鱗狀細胞癌臨床分期、淋巴結轉移、組織分化程度有關(P<0.05)，與年齡無關(P>0.05)，見表1。

表1 喉鱗狀細胞癌患者血清葉酸含量之間的關系

2.4 TSLCI表達與喉鱗狀細胞癌臨床特征TSLCI蛋白的表達與臨床分期、淋巴結轉移、組織分化程度有關(P<0.05)，與年齡無關(P>0.05)，見表2。

表2 喉鱗狀細胞癌組織中TSLC1蛋白表達之間的關系

2.5 癌癥組葉酸含量與癌組織中TSLC1表達的關系Spearman相關分析顯示：r為0.642，P<0.01，兩指標呈正相關。logistic回歸模型分析顯示，OR值為3.91，P<0.01，表明喉鱗狀細胞癌患者血清中的葉酸含量每增加0.003 μmol·L-1，TSLC1的蛋白表達陽性率增加3.91倍。

3 討論

喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢?，F已發現多個癌基因和抑癌基因的變異與其發生發展和轉歸有關[6]。多基因表達異常是其發生發展的基礎。

葉酸是一種水溶性維生素，其主要的生物學功能是作為一碳單位的載體參與細胞內的甲基化反應、DNA的成分和修復、細胞的凋亡等[7-8]。McGlynn等[9]觀察到的結腸腺瘤性息肉患者體內葉酸的濃度要明顯低于沒有息肉的正常對照組，葉酸濃度在正常結腸組織、結腸息肉的邊緣組織、息肉組織中呈梯度性降低。Sie等[10]表明，實驗孕鼠使用足夠葉酸的食物后，可顯著改變子代錯誤DNA的編碼水平，而減少結腸癌的發生。本研究結果發現，血清中的葉酸在健康對照組中的濃度明顯要高于喉鱗狀細胞癌組，并且喉鱗狀細胞癌組中隨著病變程度的加重，血清中的葉酸逐漸降低。

TSLC1是一種抑癌基因，參與細胞間的黏附、細胞間的運動、信號傳導及免疫調節，并在抑制腫瘤的發生、發展中起重要作用。TSLC1可廣泛表達于除骨骼肌外的大多數正常組織，但在許多腫瘤中，特別是侵襲性強的腫瘤中呈現低表達或不表達[11-12]。Lung等[13]運用PCR和免疫組化技術闡明了TSLC1蛋白的缺失可以作為一個在鼻咽癌患者中判斷有無淋巴結轉移的指標，在淋巴結轉移的鼻咽癌患者組織中，大部分的TSLC1蛋白表達缺失。Steenbergen等[14]研究發現，實驗中的宮頸癌細胞株82%的TSLC1基因表達的蛋白下降。在正常宮頸組織和Ⅰ度CIN組織中未檢測到TSLC1蛋白表達下降，TSLC1基因表達下降在Ⅱ度和Ⅲ度CIN組織中的檢出率分別為58%和35%，并且TSLC1表達下降的頻率隨著宮頸病變的嚴重程度、病理分級程度的增高而增加。本研究與文獻報道相似。

本研究發現隨著喉鱗狀細胞臨床分期加重、組織分化程度降低、淋巴結轉移，患者血清中葉酸含量逐漸降低，組織中TSLC1蛋白表達逐漸降低，而且葉酸濃度與TSLC1蛋白表達呈正相關，喉鱗狀細胞癌患者血清中葉酸含量減少0.003 μmol·L-1，TSLC1蛋白表達陽性率降低3.91倍，這可能是因為葉酸可以修復受損的DNA和引導正確的DNA復制，從而促使TSLC1蛋白正常表達。

葉酸缺乏可能導致基因組DNA低甲基化、組蛋白甲基化改變和致癌基因激活，致使一系列的DNA損傷、DNA鏈斷裂和染色體的破壞，參與喉鱗狀細胞癌的發生、發展過程。增加膳食中葉酸的攝入會降低患病風險，可望成為喉鱗狀細胞癌簡便易行的預防措施，同時TSLC1可能成為其基因治療的靶點，為其早期預防和臨床靶向治療提供科學依據。