產蛋白酶的中度嗜鹽菌Salinivibrio sp.MK070917的選育及產酶條件優化

耿靜，韓秋霞，高文靜，肖麗嬌

(山東科技大學 化學與環境工程學院，山東 青島 266590)

生存于曬鹽場、鹽湖和鹽礦中的嗜鹽微生物，種類豐富，在產生結構新穎且生物活性優質的天然化合物方面，因其所處的高滲透壓、缺氧等特殊的環境，具有得天獨厚的生理條件[1-3]。近年來的研究表明，嗜鹽微生物能夠分泌可以適應于高鹽環境的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等的代謝產物，這些代謝產物大多具有耐有機溶劑和耐鹽的特性，因此能夠在高鹽或低水活度條件下維持高活性和穩定性[4]。在龐大的嗜鹽微生物群體中，中度嗜鹽菌作為極端微生物的一個重要的類群，不斷地被分離鑒定，研究發現其能夠在0.5～1.5 mol/L鹽度中擁有最佳生長能力[5，6]。通過深入的研究，發現中度嗜鹽菌能抵抗外界高濃度的鹽環境，并能應對鹽度大范圍的波動，因此，與極端嗜鹽菌相比，中度嗜鹽菌有分布廣泛、營養要求較低、易于適應環境、工業應用價值高的優勢[7，8]。蛋白酶在生命過程中承擔著重要的功能，也是一種重要的工業酶制劑，目前廣泛應用于洗滌劑、食品、醫藥、制革、紡織及廢物處理等領域。然而，在高鹽或低水活度條件下，普通的蛋白酶會變性失活，因此，其在高鹽發酵食品或高鹽污水處理等特殊領域的應用也受到了限制[9-11]。而嗜鹽菌所分泌的蛋白酶，因其特殊的性質，為其在特殊領域如高鹽發酵工業、洗滌和污水處理行業等的應用提供了天然保障，拓寬了普通蛋白酶的催化和應用范圍，在生物技術領域內有巨大的應用價值。

相較于資源龐大的嗜鹽菌菌群，對嗜鹽菌蛋白酶資源的研究與利用還處于起步階段[12-14]。本研究取樣自山東濰坊昌邑某曬鹽場鹽濃度為21%的海鹽水中，通過初步的分離純化、生理生化鑒定以及分子生物學鑒定得到目標菌株Salinivibriosp. MK070917；進一步對菌株的生長過程和產酶特性進行探究，并在此基礎上，對菌株所產的胞外蛋白酶進行酶學性質的探究。

1 材料和方法

1.1 菌株樣品來源

樣品為昌邑某鹽場濃度為21%海鹽水水平面下15 cm處水樣，4 ℃暫存。帶回后稀釋水樣并涂布，分離純化后，斜面保藏至冰箱。

1.2 試劑和培養基

1.2.1 主要試劑

干酪素、福林酚試劑、三氯乙酸、碳酸鈉、L-酪氨酸。

1.2.2 培養基

Gibbons液體培養基(GM，g/L)：酪素水解物5 g，酵母浸出物10 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鈉3 g，MgSO4·7H2O 20 g，KCl 2 g，NaCl 100 g。固體GM：添加2%的瓊脂。

篩選培養基：固體GM中添加1%脫脂奶粉。

1.3 福林酚法測定蛋白酶酶活

按中華人民共和國專業標準SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法，測定蛋白酶酶活[15]。

酶活定義：在一定溫度和pH值條件下，1 mL液體粗酶1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸作為1個酶活單位，用U來表示。

1.4 產蛋白酶菌株的篩選

1.4.1 菌株的初篩

純化后的菌株點種于篩選培養基上，37 ℃倒置培養3～5 d，觀察菌落周圍是否出現透明水解圈。

1.4.2 菌株的復篩

1.4.2.1 粗酶液的制備

純化后的菌株按2%(W/V)的比例接種至液體GM中，培養至72 h的菌液在8000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清液進行測試。

1.4.2.2 菌株的復篩(平板擴散法)

脫脂牛奶-鹽-瓊脂擴散平板法：制作牛奶-鹽-瓊脂固體平板并放置牛津小杯，做標記；以空白GM做對照，未離心的菌液作為實驗組1，粗酶液作為實驗組2，分別加入到牛津小杯中，放入37 ℃培養箱中，放置12 h，觀察。

1.5 系統發育分析

活化后的菌株委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序。

序列采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法進行系統發育樹的構建。

1.6 菌株生長條件和營養物質利用

1.6.1 菌株生長條件

NaCl濃度設置為0%、5%、10%、15%、20%、25%；pH梯度為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0；溫度梯度為25，30，25，40 ℃；金屬離子添加為Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+，終濃度為5 mmol/L。活化后的菌株按2%(W/V)的比例接種后于200 r/min震蕩培養72 h；每隔4 h取樣1次，制備粗酶液，測定蛋白酶酶活。

1.6.2 營養物質的利用

以葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為唯一碳源添加到GM中；以蛋白胨、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、酪素水解物、氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸銨為唯一氮源添加到GM中，分別按2%(W/V)的比例接種，于200 r/min震蕩培養72 h，制備粗酶液，測定蛋白酶酶活。

1.7 單因素試驗和最陡爬坡試驗

對培養基的各組成部分進行產酶的單因素試驗探索，根據單因素試驗結果，分別設置4個因素的最陡爬坡試驗，按照不同因素、不同水平的設置配制培養基，活化后的菌株按2%的比例接種，于200 r/min震蕩培養72 h，制備粗酶液，測定蛋白酶酶活。單因素試驗設置分別為：碳源梯度0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%；氮源梯度0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%；KCl添加終濃度0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、3‰；檸檬酸鈉添加終濃度1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰。

1.8 響應面法優化菌株產酶條件

根據單因素的試驗結果以及Box-Behnken設計原則，4個因素分別以A(糊精)、B(蛋白胨)、C(KCl)和D(檸檬酸鈉)表示，以單因素試驗結果的最佳條件作為中水平，即0水平，響應面試驗設計的因素和水平表見表1。

表1 菌株培養條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of strain culture conditions

1.9 數據分析

生長特性和產酶特性試驗分別設置3組平行樣品，按照時間間隔分別取樣測定蛋白酶的酶活，取平均值，并繪制生長特性和產酶曲線；營養物質利用試驗、單因素試驗以及最陡爬坡試驗測定3次，用SPSS 18.0進行顯著性分析，顯著水平(P<0.05)；響應面結果根據數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離篩選

菌株MK070917在初篩平板上產生透明水解圈，說明其具有產蛋白酶的能力，結果見圖1。復篩圖結果顯示，空白培養基的存在并不能讓篩選培養基產生透明水解圈，因此排除了空白培養基所帶來的誤差；而未離心的菌液和離心后的上清液均可以讓篩選培養基產生直徑大致相同的透明水解圈，證明菌株所產的蛋白酶為胞外蛋白酶。

圖1 菌株MK070917初篩和復篩結果Fig.1 Screening and rescreening results of strain MK070917

2.2 系統發育分析

經生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S rDNA測序后，返回的測序結果提交GenBank，并利用MAGE 7.0軟件中的鄰接法進行系統發育樹的構建，結果見圖2。MK070917菌株與Salinivibrio屬內SalinivibriocosticolaS6的同源性為99%，系統發育分析歸為同種，結合形態學和生理生化特征, 確定其為Salinivibrio屬成員, 命名為Salinivibriosp. MK070917菌株。

圖2 菌株基于16S rDNA序列的系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of strain based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株生長條件和營養物質利用

圖3 菌株的生長特性和產酶特性Fig.3 Growth characteristics and enzyme production characteristics of the strain

菌株的生長條件測定見圖3。菌株可以在5%～15%的NaCl濃度范圍內生長并產蛋白酶，由圖3A可知，NaCl濃度為10%時，該菌株的生長和產酶能力最大，因此，判斷該菌株為中度嗜鹽菌，并選擇10%的NaCl濃度進行下一步生長條件的探索。由圖3B可知，pH 6.0～9.0之間菌株均可以生長并產蛋白酶，pH為5.0和10.0時，菌株無法生長。pH為7.0時，其產酶的酶活均高于其他pH條件，因此選擇pH 7.0為產酶的最適pH。由圖3C可知，菌株于25～40 ℃之間可以生長和產蛋白酶。當溫度為30 ℃時，其產酶能力最強，因此選擇30 ℃為產酶的最適培養溫度。由圖3D可知金屬離子的添加對菌株產酶的影響，Fe3+、Ni2+、Ca2+、Mn2+和Co2+的添加沒有抑制菌株的產酶，但是其產酶開始的時間為42 h左右，說明上述金屬離子的存在對于菌體前期的產酶具有一定的抑制作用，Cu2+和Zn2+的存在使得菌株無法正常生長，但是所有添加金屬離子的菌株的產酶能力相較于未添加金屬離子的原液都差。

菌株Salinivibriosp. MK070917可以利用多種營養物質作為碳源和氮源，這與已報道的嗜鹽菌產蛋白酶的特點相吻合。由圖4A可知，糊精作為碳源添加時，比原培養基中碳源酵母浸出物增加了0.25倍，也就是酶活增加了25%(P<0.05)，增加顯著，但是甘露醇的添加使得菌株無法正常生長。由圖4B可知，蛋白胨作為氮源添加時，菌株所產蛋白酶表現出來的活性最高，其他氮源的添加并沒有顯著的提高菌株產蛋白酶的能力，明膠和亞硝酸鈉的添加甚至不能使菌株進行正常生長。胰蛋白胨作為氮源添加時，是除蛋白胨作為氮源酶活最高的氮源添加，但是胰蛋白胨的添加使得蛋白酶的酶活顯著下降了33.3%(P<0.05)。因此選用麥芽糊精作為碳源替代GM中的酵母浸出物，氮源物質仍為原來的蛋白胨。

圖4 菌株Salinivibrio sp. MK070917對碳源和氮源的利用Fig.4 Utilization of carbon sources and nitrogen sources by strain Salinivibrio sp. MK070917

2.4 單因素試驗和最陡爬坡試驗

針對單因素試驗設計中對菌株產蛋白酶影響最顯著的4個因素進行最陡爬坡試驗的設計，分別于各因素各水平條件下接種，培養72 h，測定粗酶液酶活，見圖5，依次為糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和檸檬酸鈉(D)。糊精添加量1%時，酶活達到最大，糊精添加量為2%時，高濃度的糊精抑制了菌株的正常生長，產酶能力幾乎為0，糊精添加量為1.25%和0.75%時，酶活變化顯著；蛋白胨作為最優氮源，其最佳的添加量為1%，蛋白胨添加量為0.75%時，酶活變化顯著，而蛋白胨添加量為1.5%時，酶活變化不顯著；KCl的最佳添加量為1‰，KCl添加量為0.5‰和1.5‰時，酶活變化顯著；而檸檬酸鈉的最佳添加量為2‰，此處為酶活最大值點，檸檬酸鈉為1‰和3‰時，酶活變化并不顯著。然而最優發酵條件并不一定是各個單因素所得最佳條件的簡單組合，需要在單因素基礎上進行響應面試驗來確定最優的發酵培養條件。響應面試驗各因素水平的選擇為：糊精添加量0.75%～1.25%，蛋白胨添加量0.75%～1.5%，KCl添加量為0.5‰～1.5‰，檸檬酸鈉為1%～3%；蛋白酶酶活作為響應值。

圖5 產酶條件單因素試驗結果Fig.5 Single factor test results of enzymeproduction conditions

2.5 響應面優化產酶條件

以糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和檸檬酸鈉(D)為試驗因素，以蛋白酶酶活為評價指標，按照二次項回歸方程進行試驗。試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Benhken試驗方案與結果Table 2 Design and result of Box-Benhken experiment

根據表2的試驗結果，通過響應面軟件處理后確定回歸方程：酶活(U)=29.32-2.08A+0.58B+0.34C-1.83AB-1.33AC-0.38AD+0.63CD-2.45A2-2.00B2-1.85C2-1.96D2。

根據響應面試驗結果，回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析和顯著性檢測Table 3 Variance analysis and significance detection of regression model

續 表

注：“***”為極顯著，“**”為較顯著，“*”為顯著。

由表3可知，本試驗所得模型的P值為0.0076，說明模型極顯著(P<0.01)；模型失擬項的P值為0.3728，說明模型失擬項不顯著(P>0.05)。一次項A和二次項A2、B2、D2對模型的影響極顯著(P<0.01)；二次項C2對菌株產蛋白酶的影響顯著(P<0.05)。兩因子試驗，糊精和蛋白胨、KCl和糊精之間的交互作用顯著(P<0.05)。

圖6 響應面設計兩因子交互作用曲面圖Fig.6 Surface diagrams of two-factor interaction in response surface design

根據軟件所做的響應曲面圖見圖5，以蛋白酶的酶活為響應值，糊精和蛋白胨的交互作用見圖6A，糊精和KCl濃度間的交互作用見圖6B，這2個曲面圖形的頂點落在中心位置左右，區域俯視圖趨近于橢圓形，說明交互作用顯著；檸檬酸鈉和KCl濃度間的交互作用見圖6F，蛋白胨和檸檬酸鈉之間的交互作用見圖6E，蛋白胨和KCl濃度間的交互作用見圖6D，3個曲面圖形的曲線比較平穩，區域俯視圖趨近于圓形，說明交互作用不顯著；糊精和檸檬酸鈉濃度間的交互作用見圖6C，曲面圖形的曲線較陡，區域俯視圖形也趨近于橢圓形，然而橢圓形區域并無實線，說明交互作用并沒有體現在此模型中。

通過Design-Expert 8.0.5b軟件進行培養條件的優化，最優培養條件為：以Gibbons培養基為基底，NaCl濃度為10%，pH為7.0，培養溫度為30 ℃，碳源為糊精，含量為0.66%；氮源為蛋白胨，含量為1.11%；KCl的含量為1.16‰；檸檬酸鈉的含量為2.10‰；根據響應面試驗結果得出的最優方案對培養基進行配制，以此檢驗響應面法所得結果的可行性，經過3次重復性試驗，最終蛋白酶酶活可到30.192 U，與預期值30.12 U相比，其差異為0.5%，結果表明該模型合理可靠，所優化的最佳培養條件能夠被用于蛋白酶的高效產酶培養。

自鹽濃度21%的曬鹽場海鹽水中分離得到1株Salinivibrio屬的中度嗜鹽菌Salinivibriosp. MK070917，在適宜培養條件下可產胞外蛋白酶。

以Gibbons培養基為基底，對該菌株進行分離純化后，進行菌株產蛋白酶的篩選，在篩選培養基上產生較大的透明水解圈，說明其具有較強的產蛋白酶能力；進一步對菌株的生長特性和營養物質利用進行探究，得知菌株可以生長并產酶于NaCl濃度為5%～10%、pH為6.0～9.0、溫度為25～45 ℃的條件下，并可以利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、酵母浸出物、糊精和麥芽糖為碳源，利用蛋白胨、脫脂牛奶、牛肉浸粉、酪素水解物、胰蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白、氯化銨和硝酸銨為氮源；并利用單因素法結合響應面法優化了該菌株產胞外蛋白酶的最適培養條件：碳源為糊精，含量為0.66%；氮源為蛋白胨，含量為1.11%，KCl的含量為1.16‰，檸檬酸鈉的含量為2.10‰。經響應面預測的最高產酶量為30.192 U，驗證試驗結果產酶量為30.18 U，與理論值相比差異為0.5%。

3 結論

本文所研究的可產蛋白酶的中度嗜鹽菌菌株Salinivibriosp. MK070917經過優化之后，其蛋白酶的酶活顯著提高，侯靖等人對嗜鹽菌株Halorussussp. XZYJ18產胞外蛋白酶的研究和高瑞昌等人對嗜鹽古菌Halobacteriaceaesp.產胞外蛋白酶的研究以及趙夢琴對1株嗜鹽古菌產胞外蛋白酶的研究，對比發現，Salinivibriosp. MK070917所產的胞外蛋白酶粗酶，在相同的測定條件下，酶活要更高一點，開始產酶的時間也要更早一點；Mohammad Ali Amoozegar等人對Salinivibriosp. AF-2004產胞外蛋白酶的優化，對比發現，作為同Salinivibrio屬的MK070917，其生長條件除pH外基本一致，產酶開始的時間和產酶趨勢也相一致，但MK070917所產的胞外蛋白酶的酶活更高一點，產酶條件也更溫和；Dian Siti S等人對中度嗜鹽菌PseudomonasstutzeriBK AB-12所產胞外蛋白酶的研究，對比發現，Salinivibriosp. MK070917在產酶穩定性上要更高。此外，菌株所產的胞外蛋白酶可以生長于各種營養物質和含金屬離子的環境中，因此，其對于富含有機質和金屬離子的高鹽廢水的處理具有現實意義和廣泛的應用價值。菌株優化得到的發酵條件較為溫和，使得其在工業生產中更利于大規模的操作，實現批量生產，節能環保；優化所得碳源為糊精，糊精價格更便宜，而且流動性好，便于實現微生物生產中的恒化培養，其他成分的優化，極大地降低了培養基的成本，實現了培養基的最大化利用。