Fe3O4-COOH納米材料的表征及富集能力檢測

黃艷玲，程 楊，李春媛，劉鑫龍

(1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院 天津 300350；2.天津市食品研究所有限公司 天津 301609；3.天津市林業(yè)果樹研究所 天津 300384)

0 引 言

納米技術是一項新的科學技術分支，已經(jīng)發(fā)展到能源生產(chǎn)、工業(yè)生產(chǎn)及生物醫(yī)學等方面[1]。在生物學和生物醫(yī)學方面便是其中一個關鍵應用。納米粒子(NP)可以被設計成具有獨特的組成和功能，用以提供在生物醫(yī)學研究中難以想象的新工具和技術[2]。

磁性 NP平臺有多種類型，具有不同的大小、形狀、組成和功能。此外，每種類型的納米粒子都可能通過不同的技術制造出來，例如聚合物納米粒子的納米沉淀。雖然磁性 NP平臺及其制造存在差異，但隨著磁性納米顆粒應用的多樣化，在生物樣品分離富集預處理中，它們提供更多的應用領域，而且減少對昂貴和費力的預處理方案(其主要瓶頸是生物分子的分離富集)的依賴。與傳統(tǒng)色譜技術相比，生物分子磁性分離富集處理有許多優(yōu)點[3]，即：①快速分離；②處理步驟少；③蛋白質最小程度降解；④降低系統(tǒng)成本；⑤適宜復雜體系；⑥過程較溫和緩慢；⑦可以保持高通量；⑧顆粒相容性高。這主要因為它們是超順磁性的。超順磁性納米顆粒通常帶有親水涂層或其他生物相容性化合物的氧化鐵核以提高其穩(wěn)定性，磁鐵礦(Fe3O4)或磁赤鐵礦(γFe2O3)核心被廣泛使用。這些磁性 NP表現(xiàn)出很大的依賴性使其在施加外部磁場時被磁化，而在去除外加磁場時表現(xiàn)出零凈磁化，因此在生物技術領域被廣泛研究[4]。

為了解決生物分子的分離富集問題，我們通過利用 Fe3O4-COOH納米材料對微生物裂解液中的蛋白進行富集，以提高MALDI-TOF MS對蛋白檢測的靈敏性與分辨率，通過增加質譜中蛋白檢出的數(shù)量，以提高微生物指紋峰的數(shù)量，從而增強微生物鑒別的效果。對 Fe3O4-COOH納米材料合成方法、表征及富集能力檢測詳見下文。

1 材料與方法

1.1 儀器

本章所涉及的實驗儀器主要用于對磁性材料進行表征(表1)，其中主要包括場發(fā)射掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、振動探針式磁強計，分別對 Fe3O4-COOH納米材料的形貌特征、官能團與磁性大小進行分析。Milli-Q水純化系統(tǒng)、超聲波清洗器為實驗輔助儀器，主要用于 Fe3O4-COOH磁性材料的合成。

表1 主要實驗儀器設備Tab.1 Experiment apparatus and equipment

1.2 材料

本實驗所涉及的實驗材料為分析純，用于磁性材料的合成。主要實驗材料見表2。

表2 試驗藥品Tab.2 Experiment reagents

1.3 實驗方法

1.3.1 制備Fe3O4-COOH納米材料

在 20mL乙二醇中，分別加入 FeCl3·6H2O 和Na3C6H5O7(檸檬酸鈉)，溶解并超聲混勻，然后加入CH3COONa并攪拌混勻后，在200℃條件下，在高壓反應釜中加熱 8h得到黑色固體，再在外加磁場中，用超純水與無水乙醇反復清洗，最后所得的黑色固體在真空干燥箱中60℃干燥過夜。

1.3.2 Fe3O4-COOH納米材料的表征

主要利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、振動探針式磁強計分別對 Fe3O4-COOH納米材料的形貌特征、官能團與磁性大小進行分析，以判斷Fe3O4-COOH納米材料是否成功合成。

1.3.3 BSA的富集與檢測

BSA用超純水配制成 50mmol/L溶液，然后用序列級胰蛋白酶過夜水解，將所得水解液依次稀釋成不同濃度，加入由 20mmol/L的醋酸鈉溶液配制的Fe3O4-COOH 納米顆粒懸濁液，取出 100μL Fe3O4-COOH懸濁液分別加入到不同濃度的 BSA水解液中，振蕩 30min充分吸附后，磁性分離，用 10μL磷酸緩沖液與 10μL乙腈洗脫 10min，吸取 1μL洗脫液與1μL CHCA用于MALDI-TOF MS反射模式分析。將所得的質譜峰進行數(shù)據(jù)庫檢索，以確定所分析的BSA肽段。

MALDI-TOF MS反射模式分析具體參數(shù)如下：ion source 1，20kV；ion source 2，16.65kV；lens，8.73kV；pulsed ion extraction，150ns；matrix suppression，700Da.

BSA 多肽數(shù)據(jù)檢索條件：digest used，Trypsin；maximum of missed cleavages，1；mass tolerance，±90mg/mL；fixed modifications，Carbamidomethyl(C)；variable modifications，the oxidation of methionine。檢索得分大于70分為顯著。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4-COOH納米材料的表征

Fe3O4-COOH納米材料合成完畢，對其進行場發(fā)射掃描，電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、振動探針式磁強計分別對 Fe3O4-COOH納米材料的形貌特征、官能團與磁性大小進行分析。

從圖1可以看出，圖中所有 Fe3O4-COOH粒子接近于球形，同時顯示制備的 Fe3O4-COOH磁性粒子的直徑在 600nm左右。Fe3O4-COOH磁性粒子的FT-IR光譜圖(圖2)顯示，F(xiàn)e3O4-COOH 磁性粒子中-COOH 的-OH 強的紅外特征峰在 1403cm-1，另外Fe3O4-COOH 粒子的-COOˉ中 C=O 紅外吸收在1626cm-1，而且在 587cm-1的 Fe-O 伸縮振動也在Fe3O4-COOH紅外圖中被發(fā)現(xiàn)，這表明 Fe3O4-COOH磁性粒子被成功合成。磁滯回線評價了Fe3O4-COOH粒子的磁響應特性，如圖3所示。Fe3O4-COOH粒子的磁化值分別為46emμ/g，這可使磁性粒子在外加磁鐵條件下，很容易地從水溶液中分離。這表明 Fe3O4-COOH磁性粒子已經(jīng)具備了吸附蛋白的-COOˉ官能團和很強的磁性。

圖1 Fe3O4-COOH磁性顆粒掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of Fe3O4-COOH particles

圖2 Fe3O4-COOH磁性顆粒紅外譜圖Fig.2 FTIR spectrum of Fe3O4-COOH particles

圖3 Fe3O4-COOH磁性顆粒磁滯回線圖Fig.3 Hysteresis loops of Fe3O4-COOH particles

2.2 BSA的富集與MALDI-TOFMS

為了驗證 Fe3O4-COOH磁性顆粒對蛋白的富集能力，BSA蛋白溶液被胰蛋白酶消化 18h，然后稀釋成不同濃度 50fmol/μL和 5fmol/μL的 BSA 水解溶液，通過 Fe3O4-COOH磁性顆粒對其進行富集，觀察Fe3O4-COOH磁性顆粒富集低豐度多肽的能力，在900～2100Da的質量范圍內分析 BSA蛋白的酶裂解產(chǎn)物。BSA 的胰酶裂解產(chǎn)物(50fmol/μL)被 Fe3O4-COOH磁性顆粒富集的質譜圖顯示在圖4(a)。經(jīng)過Fe3O4-COOH磁性顆粒富集，13個匹配的多肽峰可以被質譜檢測到，其序列覆蓋度達到 20%。這些峰值的相應匹配序列顯示在表3中。

當 BSA 胰蛋白酶消化的濃度降低到 5fmol/μL時，如圖4(b)所示，在沒有任何富集時，質譜中不能檢測到任何多肽信號。而 Fe3O4-COOH磁性顆粒富集后，如圖4(c)所示，仍有 4個匹配的肽段出現(xiàn)在MALDI-TOF MS質譜圖中，4個匹配峰是：1283.7634、1478.4624、1494.4872、1567.6283m/z(圖4c)。結果表明，F(xiàn)e3O4-COOH磁性顆粒具有較強的低豐度多肽富集能力。

圖4 BSA胰蛋白酶解多肽分別用 Fe3O4-COOH富集(100μL，10mg·mL-1)和不富集的 MALDI 譜圖Fig.4 MALDI spectra of BSA trypsin digestion peptide without and with enrichment using Fe3O4-COOH(100μL，10mg·mL-1)

3 結 論

Fe3O4-COOH納米顆粒具有合成簡單、應用成本低的特點。本研究成功地合成 Fe3O4-COOH納米顆粒，并對其進行表征，同時利用 Fe3O4-COOH納米粒子對 BSA裂解液中的菌體蛋白進行富集，不僅可以提升MALDI/TOF MS檢測的分辨率和靈敏性，而且可以增大BSA檢測限。因此Fe3O4-COOH納米顆粒富集菌體蛋白的方法有可能推廣應用于致病菌菌株水平鑒別。

表3 BSA胰蛋白酶消解多肽(50 fmol·μL-1，5 fmol·μL-1)利用Fe3O4-COOH磁性顆粒富集的Mascot搜索結果Tab.3 Mascot search results for BSA(50 fmol·μL-1 and 5 fmol·μL-1)digested by trypsin with enrichment using Fe3O4-COOH particlesa