云南鹽津烏骨雞與武定雞肌肉蛋白質組學差異研究

肖智超,王桂瑛,王雪峰,谷大海,普岳紅,徐志強,范江平,葛長榮,廖國周,*

(1.云南農業大學，云南省畜產品加工工程技術研究中心,云南昆明 650201;2.云南農業大學，食品科學技術學院,云南昆明 650201)

云南省地方家雞資源豐富,鹽津烏骨雞及武定雞都是云南優良地方家雞品種的代表。鹽津烏骨雞產于云南省鹽津縣,因生長分布于烏蒙地區得名“烏蒙珍禽”,它集味美、保健、藥用于一體,體型外貌和生成性能相對穩定,屬于藥用肉蛋兼用型品種[1]。武定雞主產于武定、祿勸兩縣,屬肉蛋兼用型品種,具有體型大、產肉多、肉嫩脂豐、皮脆骨酥、味鮮質優、適應性強、耐粗飼、善于覓食等特點[2]。

肉質性狀主要受基因和蛋白質調控,運用蛋白組學技術,通過對不同動物以及部位的肌肉蛋白質進行研究分析,可進一步探尋肉品質與肌肉蛋白質之間的聯系。近年研究表明,蛋白質組與肉的嫩度有很多相關性。肌肉嫩度主要是由肌纖維相關組成蛋白、可溶性的肌肉組織和肌節調控共同影響的[3]。此外,肌間脂肪含量也會間接影響肉的嫩度[4]。目前,研究者已對鹽津烏骨雞和武定雞理化特性[5-8]、遺傳多樣性[9-10]等方面進行分析,而對其肌肉蛋白組鮮有報道,因此比較這兩種地方家雞品種不同部位蛋白質差異,對人們了解家禽生長期間肌肉蛋白質變化,探討肌肉生長于肉品品質的相關性具有重要意義。雙向凝膠電泳(Two dimensional electrophoresis,2DE)是目前蛋白質組學最常用的方法之一[11],將雙向電泳和質譜鑒定相結合的蛋白質組學技術可有效分析肌肉中數以千計的蛋白質表達量。目前,與家禽肉質相關的蛋白質組學研究還較少,廖國周等[12]對騰沖雪雞的胸肌、腿肌的蛋白質差異點進行分析,發現110個點存在差異表達。Doherty等[13]發現蛋雞在不同生長時期,其雞胸肉中與生長相關的幾種蛋白質在表達水平上差異顯著。

本文以鹽津烏骨雞及武定雞為研究對象,分析其腿肌與胸肌中蛋白表達差異,并對分離的差異蛋白點利用基質輔助激光解析電離-串聯飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)進行鑒定,對比研究鹽津烏骨雞和武定雞特有蛋白質,為進一步研究地方家雞特征性蛋白提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

140日齡鹽津烏骨雞、武定雞母雞各6只(屠宰后分別選取腿肌和胸肌作為樣品,同一部位做三次重復并置于-80 ℃儲存) 云南農業大學實驗種雞場;胎牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)標準品、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、碳酸氫銨 美國Sigma公司;三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris-base)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸 美國Amresco公司;N,N,N,N-四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)、過硫酸銨(ammoniumpersulfate,AP)、碘乙酰胺 美國Amersham公司;胰酶與十二烷基磺酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS) 美國Promega公司;固相pH梯度緩沖液(pH4.0～7.0) 美國GE公司;固相pH梯度干膠條(24 cm,pH4.0～7.0) 美國Bio-Rad公司;其它試劑均為分析 純國藥集團。

EttanIPGphor III等電聚焦電泳儀 美國GE Healthcare公司;EttanDALTsix二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 美國GE Healthcare公司;Powerlook1100凝膠掃描儀 美國Umax公司;Autoflex speedTMMALDI-TOF/TOF質譜儀 德國Bruker Dalton公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質的提取及純化 取1 g肌肉樣本于研缽中加入液氮研磨成粉后加入10倍體積-20 ℃預冷的10% TCA/丙酮溶液,置于-20 ℃沉降過夜,在4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min,棄上清液,沉淀物加預冷丙酮洗滌后,再于4 ℃、12000 r/min條件下離心15 min,重復操作2次,沉淀經真空干燥后,置于-20 ℃備用。

1.2.2 蛋白質定量 采用Bradford法[5]進行蛋白質定量,-80 ℃保存備用。

1.2.3 雙向電泳

1.2.3.1 等電聚焦 等電聚焦電泳參照IPGphor Ⅲ等電聚焦系統使用指南進行。肌肉蛋白與水化液(含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、1% DTT、0.7% IPG(兩性電解質)緩沖液、0.002%溴酚藍)充分混合后取460 μL上樣。非線性IPG干膠條放入水化液,覆蓋一層礦物油防止等電聚焦時尿素析出、蛋白氧化及產生冷凝水,置于EttanIPGphor等電聚焦儀中,重泡脹和等電聚焦均在20 ℃進行,每根膠條限流50 μA。

1.2.3.2 膠條平衡 等電聚焦完畢后,膠條先在8 mL平衡緩沖液Ⅰ(pH8.8的0.05 mol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍、0.1 mol/L DTT)中平衡15 min,再在8 mL平衡緩沖液Ⅱ(除0.25 mol/L碘乙酰胺替換0.1 mol/L DTT外,其余組分同平衡緩沖液Ⅰ)中平衡15 min。

1.2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 將平衡后的IPG膠條轉移至濃度12.5%的凝膠上端,用0.8%低熔點瓊脂糖封頂,待瓊脂糖凝固后即可進行第二向SDS凝膠電泳。電泳參數設置:2 W/gel,運行45 min,然后17 W/gel,直至溴酚藍指示線跑至膠底緣時電泳結束,約4.5 h。IPG膠條的最大電流為50 μA/gel,凝膠厚度為1 mm。

1.2.4 染色與圖像分析 電泳結束后剝離凝膠,置于考馬斯亮藍溶液中固定染色2～4 h,換脫色液脫色,直到背景無色透明,蛋白點清晰為止。脫色后的雙向電泳凝膠經掃描儀掃描保存圖像,圖像分析采用imageMaster 2D platinum 5.0軟件進行。

1.2.5 質譜樣品制備 使用MALDI-TOF/TOF質譜儀對差異蛋白點進行質譜檢測,激光波長為355 nm,重復速率為200 Hz,加速電壓為20 kV,最優質量分辨率為1500 u。

1.3 數據處理

使用imageMaster 2D platinum 5.0軟件對凝膠圖像進行分析。當兩組樣品間蛋白的相對豐度比>1.5且p<0.05則判斷為差異蛋白點。

蛋白質質譜數據分析先采用軟件flexAnalysis過濾基線峰、識別信號峰,以BioTools軟件搜索NCBI數據庫,尋找匹配的相關蛋白質并鑒定蛋白質種類。

2 結果與分析

2.1 鹽津烏骨雞、武定雞肌肉蛋白質組的雙向電泳圖譜

由圖1～圖4可見,電泳分離較充分,武定雞腿肌肉共發現(1585±19)個蛋白質點,胸肌肉共發現(1516±28)個蛋白質點;鹽津烏骨雞腿肌肉共發現(1421±34)個蛋白質點,胸肌肉共發現(1329±25)個蛋白質點。通過imageMaster 2D platinum軟件分析凝膠上的蛋白質點發現,鹽津烏骨雞腿肌、胸肌與武定雞腿肌、胸肌的雙向電泳表達譜基本相似,但是有部分蛋白點的表達有差異,兩兩進行比較分析發現,鹽津烏骨雞腿肌比其胸肌表達量高的有55個蛋白點,胸肌比腿肌表達量高的有54個蛋白點;鹽津烏骨雞腿肌與武定雞腿肌相比較,鹽津烏骨雞比武定雞表達量高的有28個蛋白點,武定雞比鹽津烏骨雞表達量高的有59個蛋白點;鹽津烏骨雞胸肌與武定雞胸肌相比較,鹽津烏骨雞比武定雞表達量高的有44個蛋白點,武定雞比鹽津烏骨雞表達量高的有47個蛋白點;武定雞腿肌比其胸肌表達量高的有69個蛋白點,胸肌比腿肌表達量高的有49個蛋白點。在鹽津烏骨雞腿肌、胸肌蛋白電泳圖譜上選取11個差異倍數大于2倍且達到顯著水平(p<0.05)的蛋白點,如圖1、圖2所示;在武定雞腿肌、胸肌蛋白電泳圖譜上選取13個差異倍數大于2倍且達到顯著水平(p<0.05)的蛋白點,如圖3、圖4所示。

圖1 鹽津烏骨雞腿肌雙向電泳圖譜

圖2 鹽津烏骨雞胸肌雙向電泳圖譜

圖3 武定雞腿肌雙向電泳圖譜

圖4 武定雞胸肌雙向電泳圖譜

2.2 差異表達蛋白質的鑒定和數據庫檢索

選取的差異蛋白斑點經過酶解之后,以MALDI-TOF/TOFMS分析得到肽段質量指紋圖譜,獲得的m/z數據送入NCBI非冗余數據庫,通過Mascot搜索引擎檢索,檢索分值在67分以上視為可信結果(p<0.05)。根據檢索結果,鑒定的鹽津烏骨雞、武定雞腿肌和胸肌中差異表達蛋白的相關數據見表1。由表1可見,鹽津烏骨雞腿肌和胸肌中分別鑒定出8種和7種蛋白;武定雞腿肌和胸肌中分別鑒定出9種和7種蛋白,鑒定為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反應蛋白前體、B鏈α-晶狀體蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌鈣蛋白T、蛋白酶體非ATP酶調節亞單位14、熱休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假設蛋白和非特征性蛋白。

表1 鹽津烏骨雞腿肌與胸肌中差異表達蛋白的質譜鑒定結果

核纖層蛋白A是細胞核內骨架蛋白,是構成核纖層的主要成分,核纖層蛋白A和它的結合蛋白可以維持細胞核結構和機械力量,以及參與一些細胞核內活動。如果核纖層蛋白A確實嚴重則會影響生物的正常生長發育,引起肌組織的營養不良和核膜結構的紊亂[14]。磷酸葡萄糖變位酶1(PGM1)是糖原代謝的重要調節酶之一[15],許多蛋白都含有PGM1,其對蛋白的磷酸化作用可影響牛肉的嫩度[16]。烯醇酶是糖酵解途徑中的一種重要酶類,其單體主要有α、β和γ型,β-烯醇酶主要存在于心肌和骨骼肌中,也被稱為肌肉特異性烯醇酶[17-18]。以上三種蛋白在鹽津烏骨雞腿肌中含量較高,因此鹽津烏骨雞腿部肌肉擁有更強的運動能力。

原肌球蛋白(Tropomyosin,TM),廣泛分布在骨骼肌、心肌和平滑肌以及多種非肌肉細胞中,其對肌肉收縮起到重要作用[19],脊椎動物中存在4種TM,分別為TPM1、TPM2、TPM3 和 TPM4[20]。其中原肌球蛋白1(TPM1)其在小鼠、雞和鴨胸肌中具有較高表達量[21-22]。輔酶Q(CoQ)作為線粒體呼吸鏈電子傳遞和質子轉移的一個流動性載體,對細胞線粒體的生理功能具有重要的調節作用[23]。

C-反應蛋白(CRP)是由肝臟合成的一種典型急性時相蛋白,當機體患有炎癥或組織損傷等狀況時,血漿中含量極具增加[24]。可推斷鹽津烏骨雞雞胸肉中CRP含量較高可能是由于胸部肌肉患有炎癥引起的。B鏈α-晶狀體蛋白(CRYAB)屬于熱應激家族蛋白,CRYAB可以阻止細胞凋亡,進而減緩肉成熟速度,增大肌肉剪切力,其表達量與剪切力呈正相關[25-26]。超氧化物歧化酶是清除自由基的主要酶之一,它可以催化清除體內的超氧陰離子自由基,從而阻斷自由基的連鎖反應,保護機體免受其害[27]。有研究證明,SOD活性越高、MDA含量越低的肌肉,其系水力越高、肉色越鮮艷,并且肉質越細嫩[28]。乙二醛酶1是一種以谷胱甘肽作為輔酶,將甲基乙二醛轉化為乳酸的酶。原肌球蛋白1的主要作用是加強和穩定肌動蛋白絲,抑制肌動蛋白與肌球蛋白結合。肌酸激CKM(creatine kinase,muscle)是一種肌肉特異型同功酶,是肌肉發育和分化的標志也是骨骼肌能量代謝的關鍵酶[29]。磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinasePGK)是生物體糖酵解的關鍵酶,如機體缺乏磷酸甘油酸激酶則會引起生物體代謝等功能的紊亂[30]。骨骼肌根據收縮能力可分為快肌和慢肌兩種類型[31],肌鈣蛋白是調節肌肉收縮的關鍵蛋白,包括肌鈣蛋白T、I和C[32]。熱休克蛋白β-1(HspB1)具有維持細胞結構穩定,參與調節細胞生長和分化、抑制細胞凋亡和增強細胞應激耐受等作用[33]。此外,本試驗中還鑒定出一些未分類的假設蛋白和非特征性蛋白,這些蛋白質的功能以及蛋白質之間的相互作用,還有待做更進一步的研究。

3 結論

本試驗利用DE技術分離了云南鹽津烏骨雞和武定雞腿肌與胸肌中蛋白質,并以MALDI-TOF/TOF MS鑒定出其中的差異蛋白質點,得出以下結論:

利用蛋白質雙向電泳技術,發現在鹽津烏骨雞與武定雞肌肉中存在178個明顯表達差異的蛋白點,其中在鹽津烏骨雞中蛋白明顯上調的有72個,在武定雞中蛋白明顯上調的有106個。

據差異蛋白分析結果,篩選出具有統計學意義和規律性變化差異蛋白點進行質譜鑒定,經過Mascot搜索引擎檢索后成功鑒定出31個蛋白質點。為核纖層蛋白A、磷酸葡萄糖變位酶1、β-烯醇酶、原肌球蛋白1、三磷酸腺苷合成酶、C-反應蛋白前體、B鏈α-晶狀體蛋白、肌酸激酶M型、乙二醛酶1、磷酸甘油酸激酶 PGK1、慢骨肌肌鈣蛋白T、蛋白酶體非ATP酶調節亞單位14、熱休克蛋白β-1超氧化物歧化酶、以及一些假設蛋白和非特征性蛋白。