葡萄海棠果酵素發酵工藝優化及體外抑菌與抗氧化活性的研究

劉維兵,王舸楠,2,王犁燁,武亞婷,殷 娜,程方方,馬玉麒,武 運,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830000;2.中國食品發酵工業研究院,北京 100000)

酵素產業是生物發酵產業中的朝陽產業,酵素產業的發展符合國家產業政策要求,在國家重點發展大健康產業的環境下,酵素產業未來將會繼續保持較高的發展速度,發展空間也將更加廣闊。微生物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果等為原料,經多種有益菌發酵而產生的微生物發酵產品,具有抗衰老、抗菌、消炎、凈化血液,增強機體免疫能力等多種保健功能[1-2]。近年來,食用酵素發展迅速,我國大陸地區食用酵素相關研究尚處于起步階段,與發達國家和地區相比,仍有較大差距,國外的食用酵素產品在國內的售價普遍昂貴。所以,自主研發的食用酵素產品在國內有廣闊市場前景[3]。但目前國內酵素產業多以多原材料天然發酵為主,所以發酵周期長,生產成本較高。

葡萄,又名蒲桃,味甘酸、性平。葡萄果實營養豐富,除含有豐富的糖、蛋白質、有機酸外,還富含花青素、多酚、維生素B(Vitamin B,VB)、維生素C(Vitamin C,VC)等多種維生素,黃酮類化合物、礦物質和多種微量元素[4]。海棠果(CalophylluminophyllumL.),又名胡桐、海桐、紅厚殼、君子樹、海棠木、瓊州海棠,為藤黃科(Guttiferae)植物,海棠果味甘微酸、入脾、胃經、性平[5]。

新疆葡萄種植面積廣、范圍大、產量多,新疆鮮食葡萄產區主要分布在以無核白和馬奶子為主的吐哈地區,以及以阿圖什作為中心發展木納格鮮食葡萄的昌吉、伊犁、霍城、焉耆盆地等,主要種植全紅鮮食葡萄。國外80%的葡萄用于釀酒,而我國只有20%的葡萄用于釀酒,絕大多數葡萄用于鮮食,但由于鮮食葡萄受氣候和市場價格的影響較大,不易儲存和運輸,并且對食用衛生標準要求較高,從而制約了新疆鮮食葡萄產業的發展。釀酒葡萄利潤率低制約葡萄酒業發展[6]。另外，新疆海棠果種植面積正在逐漸增長,奇臺全縣海棠果種植面積已達2萬畝,新疆伊犁也有海棠果的大面積種植。

本實驗以新疆地產鮮食葡萄和海棠果為原料,酵母菌與乳酸菌先后發酵,縮短發酵時間,保證產品質量。通過真空冷凍干燥等工藝,制成葡萄海棠果酵素粉成品,以提高新疆鮮食葡萄與海棠果的利用率,延伸葡萄與海棠果的深加工產業鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄、海棠果 新疆烏魯木齊市九鼎農產品批發市場;馬克斯克魯維酵母、M40乳酸菌、大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌 新疆農業大學食品科學與藥學學院食品生物發酵與質量安全研究室;纖維素酶(50000 U/g) 上海藍季生物有限公司;果膠酶(500000 U/g) 上海源葉生物有限公司;SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所;α,α-二苯基-β-苦苯肼(DPPH)、2,2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS) Solarbio公司;其他試劑 均為分析純。

5417R高速冷凍離心機 Eppendorf公司;LE2002E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;LDZX-50KBS立式高壓滅菌器 上海申安醫療器械廠;HR40-ⅡA2生物安全柜、DW-86W100J醫用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司;Y15全自動葡萄酒檢測儀 Biosystem公司;Elx50酶標儀 BioTek Instruments公司;LGJ-25C四環凍干機 北京四環科學儀器廠有限公司;MJX-100B-2霉菌培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;E200MV R顯微鏡 Nikon Corporation Tokyo Japan。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 葡萄、海棠果→榨汁→滅菌→酶解→酵母菌發酵→乳酸菌發酵→真空冷凍干燥→葡萄海棠果酵素粉

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 榨汁與滅菌 將紫外線照射1 h后的葡萄、海棠果(去籽)用榨汁機打碎,然后將葡萄海棠果果汁放入65 ℃水浴鍋中,30 min巴氏殺菌。

1.2.2.2 復合酶酶解 采用纖維素酶和果膠酶酶解葡萄海棠果果汁,酶解成使微生物和人體易于利用的小分子糖類[7]。復合酶酶解葡萄海棠果果汁的工藝為:pH3.8、溫度50 ℃、酶解時間180 min。加酶量按質量分數添加,纖維素酶0.4%、果膠酶0.2%[8-10]。

1.2.2.3 菌種的活化和培養 酵母菌:將斜面保藏的馬克斯克魯維酵母,接種在馬鈴薯葡萄糖(Potato Dextrose Broth,PDB)肉湯中進行活化,在28 ℃恒溫培養箱內培養24 h。然后將菌液在馬鈴薯葡萄糖(Potato Dextrose Agar,PDA)培養基上進行涂布,在28 ℃恒溫培養箱內培養2～3 d。菌種經過冷凍后,生長延遲期較長,故需經過兩次繼代培養,菌液待用[11-14]。

乳酸菌:采用MRS培養基,其他活化、培養方法同酵母菌。

1.2.2.4 接種和發酵 先在25 ℃、pH3.8條件下接種0.20%酵母菌到葡萄海棠果果汁中發酵24 h,后在37 ℃條件下,接種0.50%乳酸菌,靜置發酵28 h。

1.2.2.5 真空冷凍干燥 通過真空冷凍干燥得到水分質量分數小于5%的葡萄海棠果酵素粉。真空冷凍干燥條件:冷凍溫度為-45 ℃,真空度為10～20 Pa,冷阱溫度為-80 ℃[15]。

1.2.3 酵母菌發酵單因素實驗

1.2.3.1 最佳質量比的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,發酵時間為16 h,葡萄∶海棠果的質量比分別設為3∶1、1∶1、1∶3、1∶5和1∶7。發酵結束后測定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最佳質量比。

1.2.3.2 初始pH的確定 葡萄海棠果汁自身的pH在3.8左右。在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,質量比為1∶3,用CaCO3調節發酵液酸度,分別在pH3.6、3.8、4.0、4.2和4.4條件下進行發酵,發酵時間為16 h。發酵結束后測定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的發酵初始pH。

1.2.3.3 發酵時間的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發酵溫度為25 ℃,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,質量比為1∶3,發酵時間分別設置為8、16、24、32和40 h,發酵結束后測定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的發酵時間。

1.2.3.4 接種量的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,控制發酵溫度為25 ℃,pH4.0,質量比為1∶3,分別接種0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%酵母菌進行發酵,發酵時間為24 h。發酵結束后測定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的酵母菌接種量。

1.2.3.5 發酵溫度的確定 在葡萄海棠果果汁充分溶氧的條件下,酵母菌接種量為0.20%,pH4.0,質量比為1∶3,分別控制在22、25、28、31、34 ℃條件下進行發酵,發酵時間為24 h,發酵結束后測定酵母菌濃度和SOD酶活力,確定最適的酵母菌發酵溫度。

1.2.4 酵母菌發酵正交試驗 根據單因素實驗結果,影響酵母菌發酵的主要因素有酵母菌接種量、發酵溫度、發酵時間、初始pH、質量比。故以此五因素設計L16(45)正交試驗,以酵母菌數量和SOD酶活力為評價指標,確定酵母菌發酵的最佳工藝條件。

1.2.5 乳酸菌發酵單因素實驗

1.2.5.1 接種量的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發酵液中的最適接種量,控制發酵溫度為37 ℃,發酵時間為24 h,初始pH為3.5,接種量分別設為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%,發酵結束后測定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.2 發酵時間的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發酵液中的最適發酵時間,控制乳酸菌接種量為0.50%、發酵溫度為37 ℃,初始pH為3.5,發酵時間分別設置為12、16、20、24、28和32 h,發酵結束后測定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.3 發酵溫度的確定 為確定乳酸菌在葡萄海棠果發酵液中的最適發酵溫度,控制乳酸菌接種量為0.50%,初始pH為3.5,分別在35、37、39、41和43 ℃條件下進行發酵,發酵時間為28 h,發酵結束后測定乳酸菌濃度和可滴定酸度。

1.2.5.4 起始pH的確定 控制發酵溫度為37 ℃,乳酸菌接種量為0.50%,采用CaCO3和NaOH調節葡萄海棠果發酵液酸度,調節pH在3.2、3.5、3.8、4.1和4.4條件下進行發酵,發酵時間為28 h。發酵結束后測定葡萄海棠果發酵液中乳酸菌數量和可滴定酸度含量,以此確定乳酸菌的最適發酵起始pH。

1.2.6 二次發酵中乳酸菌最佳接種時間的確定 乳酸菌利用葡萄與海棠果營養成分的速率快于酵母菌,所以先接種酵母菌進行發酵,再接種乳酸菌進行發酵[16-21]。根據試驗實際情況,因為乳酸菌為二次發酵,且在酵母菌發酵中會產生許多產物及各其他指標數量會發生變化,如酵母菌數量、總糖含量、脂肪含量等,所以在二次發酵過程中,不對乳酸菌的二次發酵采取正交試驗分析。

首次進行的酵母菌發酵葡萄海棠果果汁,除發酵時間外,其他發酵工藝參數均用表1正交試驗確定的最佳工藝條件,將發酵時間設定為16、24、32 h。其次進行乳酸菌二次發酵,根據乳酸菌發酵單因素實驗,選出的各個最佳單因素為最佳發酵工藝,來進行二次發酵葡萄海棠果發酵液,總發酵時間設定為52 h。通過測定酵母菌濃度、乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、花青素含量、多酚含量、DPPH自由基清除能力及ABTS+自由基清除能力,從而確定乳酸菌的最佳接種時間。

表1 L16(45)正交試驗的因素與水平

1.2.7 葡萄海棠果酵素粉體外抗氧化試驗 取葡萄海棠酵素粉6.0 g,用無水乙醇定容到10 mL溶液,濃度為0.6 g/mL。取該溶液適量,分別稀釋到濃度為200.0、100.0、60.0、30.0、10.0和5.0 mg/mL的葡萄海棠酵素溶液,紫外分光光度計測定DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥基自由基清除率。

1.2.7.1 DPPH清除率測定 取葡萄海棠果酵素粉稀釋液4 mL、0.02 mg/mL DPPH溶液4 mL混勻;25 ℃的恒溫水浴鍋中放置30 min 后,紫外分光光度計在517 nm 處測定其吸光值。空白組以4 mL無水乙醇代替樣品。每組測定重復三次[22]。

式中:A0表示空白組的吸光度;A1表示樣品溶液的吸光度;A2表示用無水乙醇代替DPPH時測得對應濃度的本底吸光度

1.2.7.2 ABTS+自由基清除率測定 用7 mmol/L ABTS(用5 mmol/L的PBS,pH7.4配制),加入過硫酸鉀使最終濃度為2.45 mmol/L,在室溫條件下黑暗放置12～16 h。使用前把ABTS+自由基用PBS稀釋成在734 nm波長處吸光度為(0.7± 0.02)[23]。

取10 μL葡萄海棠果酵素粉稀釋液加入到5 mL上述稀釋液中,在30 ℃溫度下反應5 min。以去離子水為參比溶液。在734 nm波長處測定吸光度。

式中:A0表示空白對照液的吸光度;A1表示樣品測定管的吸光度;A2表示樣品本底管的吸光度。

1.2.7.3 羥基自由基清除率測定 135 μL葡萄海棠果酵素粉稀釋液加入到1.4 mL的6 mmol/L H2O2,然后加入0.6 mL的20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,37 ℃溫度下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液。在562 nm波長處測定吸光度[24]。

式中:A0表示空白對照液的吸光度;A1表示樣品測定管的吸光度;A2表示樣品本底管的吸光度。

1.2.8 葡萄海棠果酵素粉體外抑菌試驗 酵母粉1 g、蛋白胨2 g、氯化鈉1 g,加蒸餾水定容至 200 mL,固體培養基加瓊脂粉4 g,121 ℃滅菌20 min。從經過活化的菌液中移取100 μL接種于LB液體培養基中,放入恒溫振蕩培養箱培養至對數生長期,備用。紙片法測定抑菌活性。

用打孔器將定性濾紙制成直徑為0.6 cm的小圓紙片。分別吸取以上培養時間的供試菌液100 μL,均勻涂布于LB固體培養基中。將滅菌濾紙片分別放入10、20、40、80、160、320 mg/mL的葡萄海棠酵素溶液中浸泡1 min,取出并貼在含菌平板上,每皿貼1片。用無菌水浸泡的濾紙片做空白對照。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置37 ℃培養箱中培養12 h,白色念珠菌培養14 h[25]。培養結束后測定抑菌圈直徑,結果取3個平行試驗測定的平均值。

1.2.9 其他指標測定方法 酵母菌菌體濃度的測定采用血球計數板法;乳酸菌菌體濃度的測定參GB 4789.35-2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》;可滴定酸度測定參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》;水分含量的測定參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測定》;可溶性固形物含量采用手持折光儀測定;超氧化物歧化酶活力的測定采用SOD試劑盒;多酚含量、花青素含量的測定采用y15全自動葡萄酒檢測儀。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵單因素實驗

2.1.1 質量比對酵母菌發酵的影響 由圖1可知,海棠果與葡萄的質量比在1∶3時,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶的活力達到最大值,分別為6.1×108CFU/mL和368.93 U/mL。將海棠果與葡萄的質量比定為1∶1、1∶3、1∶5、1∶7用于后續正交試驗。

圖1 質量比對酵母菌發酵的影響

2.1.2 初始pH對酵母菌發酵的影響 由圖2可知,隨著pH的升高,超氧化物歧化酶活力與酵母菌濃度不斷升高,當pH超過4.0后,隨著pH的升高,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力也逐漸降低。所以當初始pH為4.0時,超氧化物歧化酶活力達到最大值379.43 U/mL,酵母菌濃度也達到最大值6.2×108CFU/mL。將初始pH設為3.8、4.0、4.2、4.4用于后續正交試驗。

圖2 初始pH對酵母菌發酵的影響

2.1.3 發酵時間對酵母菌發酵的影響 由圖3可知,隨著發酵時間的延長,葡萄海棠果果汁中酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力逐漸提高,24 h以后,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力基本保持不變。將后續正交試驗發酵時間設定為8～32 h。

圖3 發酵時間對酵母菌發酵的影響

2.1.4 接種量對酵母菌發酵的影響 由圖4可知,隨著酵母菌接種量的增加,葡萄海棠果果汁中的酵母菌濃度和SOD活力也隨之提高,當接種量為0.2% 時,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力分別達到6.4×108CFU/mL 和409.25 U/mL,當接種量超過0.2%后,酵母菌數量和超氧化物歧化酶活力基本保持不變。將酵母菌接種量設定為0.1%～0.25%用于后續正交試驗。

圖4 接種量對酵母菌發酵的影響

2.1.5 發酵溫度對酵母菌發酵的影響 由圖5可知,溫度在25 ℃時,酵母菌濃度和超氧化物歧化酶活力分別達到6.5×108CFU/mL 和421.23 U/mL,隨著發酵溫度的升高,發酵速率明顯降低。將發酵溫度設定為22～31 ℃用于后續正交試驗。

圖5 溫度對酵母菌發酵的影響

2.2 酵母菌發酵工藝條件優化

由表2極差值分析,影響酵母菌濃度的因素主次順序為A>B>C>D>E,接種量酵母菌生長的主要控制因素,其次是發酵時間,最優組合是 A3B3C2D3E2。對超氧化物歧化酶活力而言,極差影響酵母菌產酶的活性的因素主次順序為A>B>C>D>E,而且最優組合也是A3B3C2D3E2。綜合來說,試驗指標越大越好,對因素A、B、C分析,確定優水平為A3、B3、C2,因素D選擇D3,由于葡萄海棠果汁本身pH為3.8,從經濟角度考慮,選擇E1。以配方A3B3C2D3E1設計試驗,得出超氧化物歧化酶活力為428.12 U/mL,酵母菌濃度為7.87×108CFU/mL。故選擇配方為A3B3C2D3E1為最佳配方,即接種量為0.20%,發酵時間為24 h,發酵溫度為25 ℃,質量比為1∶5,初始pH3.8。

表2 L16(45)正交試驗設計與結果

2.3 乳酸菌發酵單因素實驗

2.3.1 接種量對乳酸菌發酵的影響 由圖6可知,隨著乳酸菌接種量的增加,葡萄海棠果果汁中的乳酸菌濃度和可滴定酸度隨之提高,當接種量達到0.50%時,乳酸菌濃度和可滴定酸度分別達到 5.10×108CFU/mL和0.759%,當接種量超過0.50%后,乳酸菌濃度和可滴定酸度基本保持不變。故乳酸菌的最適接種量為0.50%。

圖6 接種量對乳酸菌發酵的影響

2.3.2 發酵時間對乳酸菌發酵的影響 如圖7所示,在葡萄海棠果果汁中接種乳酸菌后,隨著發酵時間的延長,當發酵時間達到24 h時可滴定酸度達到最大值,隨著發酵時間的延長,可滴定酸度基本保持不變,發酵時間達到28 h時,乳酸菌活菌數是 5.31×108CFU/mL,此時乳酸菌活菌數達到最大值,隨著時間的延長,乳酸菌活菌數略微降低,故將發酵時間定為28 h。

圖7 發酵時間對乳酸菌發酵的影響

2.3.3 發酵溫度對乳酸菌發酵的影響 由圖8可知,隨著發酵溫度的升高,發酵速率加快,當溫度達到37 ℃時,乳酸菌濃度達到最大值5.40×108CFU/mL。溫度達到37 ℃以后,隨著溫度的升高,可滴定酸度變化不大,但乳酸菌濃度卻隨溫度的升高而逐漸降低,所以乳酸菌的最適發酵溫度為37 ℃。

圖8 發酵溫度對乳酸菌發酵的影響

2.3.4 初始pH對乳酸菌發酵的影響 由圖9可知,隨著初始pH的變化,乳酸菌濃度基本保持在5.3×108CFU/mL、可滴定酸度基本保持在0.76%,乳酸菌發酵的初始pH可以選擇為3.2～4.4。由于酵母菌發酵完葡萄海棠果果汁,得到的葡萄海棠果發酵液的pH為3.5,故選擇乳酸菌發酵的初始pH為3.5。

圖9 初始pH對乳酸菌發酵的影響

2.4 復合發酵中乳酸菌的最佳接種時間

根據試驗的實際情況,因為乳酸菌發酵為二次發酵,且在酵母菌發酵中會產生許多產物以及其他指標數量會發生變化,如酵母菌數量、可滴定酸等,所以在二次發酵過程中,不對乳酸菌的二次發酵采取正交試驗分析數據的方法,而是根據最優單因素選出最佳組合進行二次發酵。

由表3可知,當酵母菌發酵16 h后再接種乳酸菌,發酵液中乳酸菌的濃度最高,但是酵母菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標較低。當酵母菌發酵24 h后再接種乳酸菌,發酵液中酵母菌濃度、乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標較高。

表3 二次發酵中乳酸菌的最佳接種時間對發酵液的影響

當酵母菌發酵32 h后再接種乳酸菌,雖然酵母菌濃度含量最高,但發酵液中乳酸菌濃度、超氧化物歧化酶活力、多酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和花青素含量等指標都有所降低。綜合以上各因素,酵母菌發酵24 h時接種乳酸菌為乳酸菌最佳接種時間。然后在37 ℃條件下,靜置發酵28 h,在此條件下制得的發酵液中酵母菌濃度為7.7×108CFU/mL,乳酸菌濃度為5.2×108CFU/mL,超氧化物歧化酶活力為485.25 U/mL。

2.5 真空冷凍干燥制得葡萄海棠果酵素產品質量指標

2.5.1 感官指標 葡萄海棠果酵素粉為淡紅色、有光澤、且顏色均勻,酵素香氣獨特且綿密,具有葡萄與海棠果特有的混合果香味,并伴有發酵香味,酸味純正、持久不刺激,組織形態松散無結塊，符合中國生物發酵產業協會團體標準、植物酵素行業標準[26-27]。

2.5.2 理化指標 水分含量≤5%;總酸≥0.9%，符合上述標準[26-27]。

2.5.3 微生物指標 乳酸菌濃度≥(5.1±0.5)×108CFU/g;酵母菌濃度≥(7.5±0.5)×108CFU/g:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、霉菌等有害微生物未檢出，符合上述標準[26-27]。

2.6 葡萄海棠酵素粉的體外抗氧化試驗

由圖10可知,葡萄海棠果酵素對DPPH、ABTS+、羥基自由基都具有一定的清除能力,而且其清除作用隨著酵素濃度的增加而增強,當濃度達到200 mg/mL時,其抑制率分別可達到(85.22%±3.2%)、(67.71%±2.4%)和(72.08%±2.5%),其中對DPPH自由基的清除作用最強,其次是羥基自由基,對ABTS+自由基的清除作用相對弱一些。

圖10 不同濃度酵素對體外抗氧化能力的影響

2.7 葡萄海棠酵素粉的體外抑菌試驗

由表4可以看出,葡萄海棠果酵素粉對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌三種致病菌均有抑制作用,對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強,其次是大腸桿菌,對白色念珠菌的抑制作用稍弱,隨著葡萄海棠果酵素濃度的不斷升高,對三種致病菌的抑制作用也在不斷升高。

表4 不同濃度的葡萄海棠果酵素的抗菌活性

2.8 葡萄海棠果酵素的理化指標及功能成分分析

2.8.1 葡萄海棠果酵素的理化指標測試結果 對 pH、可滴定酸度、多酚、花青素的理化指標檢測結果如表5。隨著發酵時間的不斷增加,葡萄海棠果酵素的pH,從最初的pH3.84到發酵結束時pH降低為3.45,發酵過程中益生菌發酵產生有機酸、乙酸等代謝產物,使反應體系逐漸走向成熟,多酚含量在52 h時達到(956±15) mg/L,比未發酵組的多酚含量有很大提升。發酵初期,由于葡萄與海棠果中本身富含葡萄糖、果糖,總糖含量較高,直至酵母菌發酵進入對數生長期,耗糖量也隨之增加;發酵后期,乳酸菌代替酵母菌變為發酵液中的優勢菌群,乙酸含量不斷增加,乙醇減少。

表5 發酵前后與制成粉制劑后理化指標對比

2.8.2 葡萄海棠酵素功能成分的測試結果 酵母菌和乳酸菌互相利用產生次代謝產物,從而提高酶活力與益生菌活菌數量,結果如表6所示,發酵結束時SOD酶活達到(485.25±12.5) U/mL。葡萄因本身含有黃酮類化合物,是天然的抗氧化活性物質,葡萄中單聚體酚類物質經益生菌的轉化與利用,DPPH、ABTS+及羥基自由基清除率分別達到了84.68%、66.68%、71.94%。發酵時乳酸菌能為酵母菌提供碳源,如牛乳生產過程中添加的酵母菌和乳酸菌,酵母菌不能直接利用乳糖,而乳酸菌可將乳糖轉化為半乳糖和葡萄糖,因此乳酸菌也為酵母菌提供了碳源;乳酸菌還可通過丙酮酸鹽裂解酶將丙酮酸鹽轉化為甲酸鹽,或者將檸檬酸鹽分解為甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、雙乙酰、乙酰甲基原醇、2,3-丁二醇等芳香物質,為發酵體系增加風味成分。有研究推測酵母菌與乳酸菌共生體系中存在一種適應反應機制,這種機制一旦被激活,酵母菌會產生“交叉保護”的現象,促使酵母菌對外界抵抗能力增強,如高滲透壓、高溫、較低pH等環境。隨著發酵時間的推進,發酵體系中pH逐漸降低,而酵母菌活力并沒有因此走向自溶或衰亡,而是與乳酸菌互相利用、達到穩定共生的平衡體系[28]。

表6 發酵前、后與制成粉制劑后功能成分指標對比

3 結論

以葡萄、海棠果為原料,經復合發酵得到最佳工藝條件為:葡萄∶海棠果質量比5∶1,發酵液在溫度25 ℃,初始pH3.8的條件下接種0.20%酵母菌,發酵24 h,然后在37 ℃條件下,接種0.50%乳酸菌,靜置發酵28 h。得到的葡萄海棠果酵素SOD酶活力為485.25 U/mL,酵母菌濃度為7.7×108CFU/mL,乳酸菌濃度為5.2×108CFU/mL。發酵制得的酵素香氣清爽、有發酵香味、酸味純正、有淡紅色光澤,且富含花青素,多酚等,有很好的抗氧化性能,且具有一定的抑菌效果。ABTS+自由基清除能力與其他自由基清除能力相比,清除率相對較低。酵素對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用。發酵工藝大大縮短了發酵時間,降低了生產成本,真空冷凍干燥使產品中益生菌有效保留,提高了產品品質。