15個大花序桉品種的AFLP分析

孫雪陽，龐貞武，黃漢寧，秦 麗

(1.廣西國有東門林場，廣西 扶綏 532108；2.廣西八桂林木花卉種苗股份有限公司，廣西 南寧 530024)

1 引言

大花序桉(Eucalyptuscloeziana)為桃金娘科(Myrtaceae)桉樹屬(Eucalyptus)傘房亞屬(Corymbia)樹種，原產于澳大利亞，位于南緯16°～26.5°，分布不連續，主要分布在昆士蘭南部[1]。其木材紋理通直、硬度高、呈黃褐色，鋸材性能優良、價值高，廣泛用于家具、建筑等，實木利用前景廣闊[2]。我國于1972年引種大花序桉，從20世紀80年代起，廣西陸續從澳大利亞引種不同種源的大花序桉種植。近年來，隨著人們對優質木材的需求上升，大花序桉因其速生性以及優良材性進入了人們的視線。但目前市面上苗木較雜，為弄清它們之間的關系，筆者選取了部分實生苗、組培苗以及種源試驗林、母樹林單株進行AFLP分子標記，以期驗證它們之間的親緣關系，弄清苗木來源。

2 材料和方法

2.1 材料

15個大花序桉樣品分別采自廣西國有東門林場中心苗圃、大花序桉母樹林、種源試驗林、廣西八桂林木花卉種苗股份有限公司三塘苗圃以及合山市柳花嶺林場試驗林等地點。于晴朗天氣，選取健壯、無病蟲害植株嫩葉5～10片，放在裝有變色硅膠的封口袋中干燥后，放入-20 ℃低溫冰箱中保存備用。

2.2 試驗方法

本次試驗選用AFLP((Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態性)分子標記。該標記方式是對基因組總DNA雙酶切后經PCR進行選擇性擴增，由于不同來源DNA的酶切片段存在差異，因而產生了擴增產物的多態性[3]。試驗過程主要包括DNA的提取(CTAB法)、限制性酶切及酶切片段連接、預擴增、選擇性擴增、凝膠電泳，具體步驟參考相關文獻[4，5]進行。試驗中預擴增引物使用EcoRI: 5’> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3’，MseI: 5’> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3’。選擇性擴增引物EcoRI-AAC、AAG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGC、AGG(5ng/μL)8種，MseI-CAA、CAC、CAG、CAT、CTA、CTC、CTG、CTT(30ng/μL)8種，兩兩組合，共64對引物。

表1 供試材料和來源

2.3 數據分析

通過GENESCAN軟件打開膠圖進行分析，軟件每2個堿基讀取一次，Marker片段范圍為 70～500 bp，每對引物讀取216條條帶，得到原始數據。由于AFLP是顯性標記，即同一對引物組合擴增產物中電泳遷移率一致的條帶具有同源性[6]，因此可在原始數據的基礎上，進行轉換，有數值記作“1”，無數值則記為“0”，從而生成由“l”和“0”組成的原始矩陣。用NTSYSpc-2.11F軟件進行數據分析。對原始矩陣用SimQual程序求相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣。用UPGMA法對得到的相似系系數矩陣進行聚類分析。

3 結果

采用改良CATB法提取DNA，電泳檢測DNA條帶清晰(圖1)，滿足AFLP標記要求。進行EcoRI/MseI雙酶切，所獲片段在膠板上分布均勻，多態性十分豐富。從64對引物中篩選出8對條帶清晰，多態性好的引物(圖2)，即E-AAC/ M-CAA、E-AAC/ M-CAG、E-AAC/M-CTC、E-ACA/M-CAC、E-ACC/M-CAC、E-ACG/M-CAT、E-AGG/M-CAC和E-AGG/ M-CAG。8對引物擴增各得到條帶142、140、174、174、174、146、164、130條，共計1244條，其中多態性條帶1238條，多態性比率為99.6%。

圖1基因組DNA電泳

圖2 供試樣品AFLP指紋圖譜(E-AAC/M-CTC)

基于上述1244條條帶計算樣品兩兩之間的相似性系數(依照Nei和Li的方法)，得到相似性系數矩陣，聚類分析后獲得樹狀分枝圖(圖3)。聚類結果表明，在相似系數0.77處，將15個大花序桉材料分為六組，第一組：組培苗DM1、種子苗1-2以及來自母樹林的S14427；第二組：lhl002、來自母樹林的S12196以及來自種源試驗林的E111-4、E111-6、E632；第三組：1212和1224；第四組：只有來自母樹林的B47；第五組：只有種子苗3；第六組：1203和1204。15份樣品的相似性系數在0.74～0.84之間，1203與種子苗3親緣關系最遠，為0.74；1212與1224親緣關系最近，為0.84。

圖3 基于Nei和Li相似性系數得到的聚類分枝

4 討論

(1)本試驗中的多態性比率極高，蒙古櫟[7]也有這種情況，較大可能包含假多態性條帶。可能是引物篩選不理想，或者是樣本受到污染，干擾了試驗結果。此次試驗讀取的數據是大小在70～500 bp之間的清晰條帶，實際產生的條帶要比記錄讀取的多。70～500 bp讀數范圍能夠較好的應用于八角、蘋果[8]等樹種的聚類，但可能不適用于大花序桉。通過查閱文獻，發現相當一部分樹種在更寬的范圍內讀取數值，比如：杉木[9]ISSR分子標記凝膠電泳讀數范圍在200～4000 bp；光皮樺[10]AFLP分子標記凝膠電泳讀數范圍在100～2000 bp；若擴展讀數范圍將會找到更多的特征譜帶用于區分不同品種的大花序桉，更好地排除干擾因素，提高試驗準確性。今后研究中在取樣方法、DNA提取、標記方式選擇等方面需要進一步驗證。

(2)采自合山市柳花嶺林場的Lhl002與來自母樹林的S12196以及來自種源試驗林的E111-4、E111-6、E632聚為一組，說明它們之間親緣關系較近，可能來自同一種源。經咨詢相關負責人，了解到Lhl002確實來自該種源試驗林，從一方面驗證了試驗的準確性，說明利用分子標記弄清大花序桉親緣關系是可行的。母樹林的三個樣本分別聚為三類，表明所建立的母樹林遺傳多樣性豐富，為后續遺傳改良提供了理想的遺傳資源。

(3)進入21世紀以來，桉樹作為速生豐產樹種，在廣西得到極大發展，但推廣種植品種單一，多為尾葉桉與巨桉的雜交種中選育的無性系，且以紙漿材為主，實木利用少之又少。在限桉政策下，培育實木用途的大花序桉替代部分速豐桉林，不僅能夠豐富造林樹種種類，而且能夠取得不錯的經濟效益。經過多年的引種，對大花序桉遺傳多樣性已有較深的認識，各地的種源引種試驗均發現種源間存在顯著的差異[11]，在種源內、家系內個體間亦存在豐富的變異[12]，說明大花序桉具有較高的遺傳多樣性。繼續引入大花序桉種源，開展更為豐富的種源試驗，利用分子標記技術輔助育種，盡快培育出更多的能夠用于生產的良種資源是當務之急。