高脂飲食誘導的肥胖對小鼠精子線粒體及活動力損傷的機制研究

彭媛紅 敬 佳 胡燕琴 劉 悅 丁之德

上海交通大學醫學院 組織胚胎學與遺傳發育學系；上海市生殖醫學重點實驗室（上海 350001）

肥胖是一種代謝疾病，其影響因素有很多，包括機體是否適當運動、生活方式（食物的種類和攝入量）、環境以及遺傳因素等[1]。近幾十年來，肥胖以其日益增加的流行性和與多種慢性疾病的相關性成為世界范圍內的一個主要健康問題。根據世界衛生組織2018年的報告顯示，截止到2016年，世界范圍內18歲及以上成年人中有超過19億的超質量[體質量指數（body mass index,BMI）≥25]人口，其中有超過6.5億的肥胖人群（BMI≥30）[2]。我國國家衛生和計劃生育委員會頒布的成人體質量判定，將24≤BMI＜28定義為超質量，28≤BMI定義為肥胖[3]，從1975年到2014年，我國肥胖人口迅速激增，2013年我國肥胖人口數量已居世界首位[4]。值得注意的是，我國育齡年齡段即20至39歲的人群中，肥胖率高達11.1%[5]。由此可見，我國的肥胖問題相當嚴峻，亟需引起高度重視。

很多研究顯示，肥胖與2型糖尿病和胰島素抵抗密切相關，其與心腦血管疾病的發生也有很大的關系[7]。另外，肥胖也被證實與癌癥以及一系列骨骼肌疾病的發生有關[8]。目前，除了先天遺傳因素造成的肥胖以外，學者們更為關注的是環境因素引起的肥胖，尤其是飲食結構和生活習慣導致的肥胖。長期進食高卡路里食物如高脂飲食是當前肥胖癥發病的一個很大誘因。肥胖作為一種由代謝紊亂引起的疾病，往往伴隨著線粒體的功能障礙[9]。線粒體的動力學受到代謝需求的調控。代謝信號變化時，線粒體會做出相應的動態變化，如融合和裂變，以適應代謝的需求。細胞代謝水平的改變會影響線粒體的數量、組成和功能。高脂飲食引起的肥胖會破壞線粒體的呼吸作用，造成氧化應激反應，繼而導致活性氧水平增加[10]、線粒體膜電位降低[11]。研究表明高脂飲食誘導會引發超質量大鼠線粒體生物合成和融合過程的減少以及裂變的增加[12]。通過檢測線粒體超微結構[13]、膜電位[14]、mtDNA 拷貝數[15]，可以準確分析線粒體的結構、功能和數量，綜合評估線粒體功能。

近年來，肥胖對男性生殖功能的影響越來越引起研究者們的關注。臨床研究表明，超質量和肥胖的男性與BMI正常的男性相比，精子的質量明顯下降，表現為精子濃度下降、精子活動力降低、頂體反應異常、精子形態異常、精子DNA損傷增加[16]等。有研究統計了1973年至2011年，北美、歐洲、澳大利亞和新西蘭等國家的男性精液質量表明：近四十年來，男性精液質量明顯下降，而營養攝入和飲食習慣的改變是影響其精液質量的重要因素[17]。這也促使我們關注由飲食因素引起的肥胖對雄性生殖的影響。線粒體被認為是評估精子質量最重要的細胞器。大量的研究已經表明，肥胖能夠明顯損傷男性生殖功能，其中最為顯著的就是精子活動力的損傷，然而肥胖引起的雄性精子活動力低下是否與線粒體異常有關尚未可知。

因此，本研究擬通過高脂飲食誘導構建雄性肥胖小鼠模型以模擬由飲食引發的肥胖癥；隨后觀察小鼠睪丸的形態結構，檢測小鼠雄性生育力各項指標，并進一步檢測小鼠精子線粒體功能及數量以探究肥胖導致小鼠精子質量下降的機制。

材料與方法

一、實驗動物

3周齡的C57BL/6雄性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；45%fatKcal%（MD12032）高脂飼料和10%fatKcal%（MD12031）對照組飼料購自江蘇美迪森公司。

二、主要試劑與儀器

（一）試劑

Tyrode's Salt Solution（Sigma-Aldrich），羅丹明 123染液（DOJINDO），JC-1染液（上海翊圣生物科技有限公司），Percoll試劑（上海翊圣生物科技有限公司），血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒 （北京天根生化科技有限公司），SYBR Premix Ex Taq（2×）（TaKaRa）。

（二）主要儀器

計算機輔助精液分析儀（Hamilton Thorne），流式細胞檢測儀 CytoFLEX LX（Beckman），ND-1000 紫外分光光度計（NanoDrop），熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems 7500），數碼顯微鏡（Nicon E600）。

三、方法

（一）構建肥胖實驗動物模型

購入3周齡的C57BL/6雄鼠后將其安置于上海交通大學醫學院實驗動物中心飼養。在適應性飼養一周后，將小鼠隨機分成正常飲食（control diet,CD）組和高脂飲食（high-fat diet,HFD）組，并給予相應飲食喂養。使用苦味酸對小鼠進行標記，每周稱量小鼠體質量并記錄直至第14周。所有小鼠均處于12 h光照12 h黑暗且能夠自由飲水的SPF級實驗動物飼養環境中。

（二）小鼠肝臟及睪丸形態學觀察

采用過量的3.5%水合氯醛麻醉處死已建模成功的小鼠，取其肝臟及睪丸置于Bouin氏液中浸泡并固定過夜，梯度乙醇脫水處理后用石蠟包埋組織，二甲苯脫蠟后再用梯度乙醇復水處理，室溫下晾干后進行HE染色處理，最后用中性樹膠封片，置于數碼顯微鏡下觀察并拍照。

（三）小鼠生育力參數檢測

相同方法處死小鼠后取出其附睪尾部組織，置于37°C預熱的Tyrode's緩沖液中，用眼科手術剪稍剪2～3 刀， 隨后在 37°C 5%CO2培養箱中培養 15 min，使精子能夠充分游出。取上清至1.5 mL Ep管中，充分混勻后取10 μL滴至預熱的Marker板 （精子標本檢測容器）凹槽中，將檢測板置于CASA儀上隨機選擇若干視野，保證所看到的精子數大于400個，分析并記錄精子運動力百分數、前向運動力及濃度等指標。

（四）JC-1染色檢測小鼠精子線粒體膜電位

按照說明書配制JC-1染液，經CASA儀確定精子的濃度，精子終濃度選定為2×108個/400μl，隨后按照精子培養液與染液1:1的比例對精子進行染色，置于37°C 5%CO2培養箱中培養20 min，按照說明書配制洗滌液，500×g 離心 5 min，重復此步驟 3 次，400 μL 洗滌液重懸后經流式細胞儀對樣品進行檢測。每管樣品的終體積為 400 μL。

（五）羅丹明123染色檢測小鼠精子線粒體膜電位

取上述已經檢測了濃度的精子樣本，按照染液終濃度為20μM，體系終體積為400μL，精子終濃度為2×108個/400μL的比例，向精子樣本中加入羅丹明123染液，置于37°C 5%CO2培養箱內孵育30 min，隨后500×g離心5 min，用PBS清洗樣本兩次，400μL PBS重懸樣本后經流式細胞儀對樣品進行檢測。

（六）流式細胞儀檢測小鼠精子線粒體膜電位

使用流式細胞儀檢測樣品，CytExpert軟件分析收集的樣品信息，樣品的吸取速度為30 μl/min，FITC通道收集由羅丹明-123染色的精子熒光信號，激發波長為507 nm，發射波長為529 nm。FICT和PE通道分別同時收集由JC-1染色的精子熒光信號，其中綠色激發波長為490 nm，發射波長為530 nm，紅光激發波長為525 nm，發射波長為590 nm。共收集10000個精子。

（七）檢測小鼠精子mtDNA拷貝數

根據說明書提取小鼠精子DNA，經q-PCR儀檢測mtDNA的拷貝數，反應程序設置為：第一步，預變性：95°C 15 s； 第二步，PCR 反應： 95°C 15 s,60°C 60 s，40個循環；獲得溶解曲線。隨后，根據Ct值計算相應的目的基因表達量，2-△△Ct法確定兩組小鼠基因的相對表達水平。引物序列來源于之前已經報道的文獻[18]。MTCYTB引物：上游引物5'-ACCAATCTCCCAAACCATCA-3'，下游引物 5'-TCCAGAGACTTGGGGA TCTAAC-3'；MTCO1引物：上游引物 5'-CTCGCCTAATTTATTCCACTTCA-3'，下游引物5'-GGGGCTAGGGGTAGGGTTAT-3'；MTCO2引物：上游引物5'-ACCTGGTGAACTACGACTGCTAGA-3'，下游引物5'-TGCTTGATTTAGTCGGCCTGGGAT-3'；MTND1引物：上游引物5'-GGGATAACAGCGCAATCCTA-3'，下游引物 5'-ATCGTTGAACAAACGAACCA-3'；MTATP6引物：上游引物5'-CAGTCCCCTCCCTAGGACTT-3'，下游引物 5'-TCAGAGCATTGGCCATAGAA-3'；β-actin引物：上游引物 5'-GGGAAT GGGTCAGAAGGACT-3'，下游引物5'-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3'。

（八）統計學分析

使用SPSS軟件對數據進行分析，GraphPad Prism 6軟件繪制柱狀圖，所有的數據均以平均值±標準差的形式表示，兩組數據之間的比較采用獨立樣本t檢驗的方法進行計算，雙尾假設置信區間為0.95，P＜0.05。

結 果

一、兩組小鼠體質量比較及肝臟形態學分析

高脂飲食喂養小鼠4周，即鼠齡為7周時，兩組小鼠體質量出現明顯差異，隨著喂養時間的延長，兩組小鼠的體質量差異愈發顯著，鼠齡為14周時，兩組小鼠體質量分別為 HFD 組（32.25±0.37）g 和 CD 組（27.30±0.29）g，差異具有統計學意義（P＜0.01）。觀察兩組小鼠肝臟的HE染色切片發現，與CD組小鼠相比，HFD組小鼠的肝臟細胞空泡化現象明顯，呈現出嚴重的脂肪肝現象，見圖1。

圖1 CD組和HFD組小鼠在喂養相應飲食10周后體質量變化及肝臟形態學分析

二、兩組小鼠生育力參數比較及睪丸形態學分析

經CASA儀檢測小鼠精子生育力的各項參數后發現，與 CD 組（63.10±8.08）%相比，HFD 組小鼠（44.80±3.82）%精子活動力百分數明顯降低（P＜0.01），HFD組小鼠精子前向運動精子百分率 （20.10±4.01）%也明顯低于CD組小鼠（25.10±4.42）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。 這表明肥胖小鼠精子的活動力和前向運動力都明顯下降，而二者的精子濃度卻沒有顯著差異，其中CD組 (26.81±4.87106/mL)，HFD 組(28.09±7.49106/mL)，見圖 2。

睪丸的形態學分析結果顯示，與CD組相比，HFD組小鼠的睪丸形態明顯異常，其睪丸生精上皮組織明顯萎縮，生精細胞排列松散，支持細胞和生精細胞之間黏附減弱，出現大量間隙。由此可見，肥胖小鼠睪丸的生精功能受到了損傷，見圖2。

圖2 CD組和HFD組小鼠生育力參數及睪丸形態學分析。

三、JC-1染色顯示肥胖組小鼠精子線粒體膜電位顯著降低

使用JC-1對兩組小鼠精子線粒體進行染色，發出紅色熒光表明線粒體的膜電位處于較高的狀態，而綠色熒光則表明線粒體膜電位較低。結果顯示，小鼠的精子染色后紅光與綠光的平均熒光強度比值HFD組 （8.88±0.62）明顯低于 CD 組（11.61±0.58）小鼠，差異具有統計學意義（P＜0.01）。該結果說明HFD組小鼠精子線粒體膜電位降低，表明其精子線粒體功能受損明顯，見圖3。

四、羅丹明123染色發現肥胖組小鼠精子線粒體膜電位顯著降低

使用羅丹明123染液對小鼠的精子線粒體進行染色，隨后經流式細胞儀分析各自的熒光強度。在線粒體膜電位較低時，羅丹明123會從線粒體釋放到胞漿中而發出強烈的熒光，因此熒光強度與膜電位成反比。與CD組相比，HFD組小鼠精子線粒體染色后的陽性區域向右偏移，這表明其熒光強度明顯增高。與CD組（253129.99±53714.50）相比，HFD 組（330619.58±47965.79）小鼠精子線粒體的平均熒光強度顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.01），提示其精子線粒體膜電位降低，線粒體功能受損。該實驗結果與運用JC-1染色的結果高度一致，也進一步說明肥胖可導致小鼠精子線粒體功能受損，影響小鼠的精子活動力，見圖4。

圖3 使用JC-1染液分別對HFD組和CD組小鼠精子線粒體染色結果

圖4 羅丹明-123對CD組和HFD組小鼠精子染色結果

五、HFD組小鼠精子mtDNA拷貝數無明顯變化

為了探究兩組小鼠精子線粒體數量是否存在差異，我們對兩組小鼠精子mtDNA拷貝數進行了統計分析，結果發現兩者不存在統計學差異，表明HFD組小鼠精子線粒體數量正常，見圖5。

圖5 CD組和HFD組小鼠精子mtDNA拷貝數

討 論

當前，肥胖已經成為影響全球人類健康的重要危險因素之一，其危害不容忽視。本研究通過構建肥胖雄鼠模型以模擬由于飲食改變而引起的肥胖癥，從而進一步探究肥胖影響雄性生育功能的作用機制。實驗發現，在高脂飲食喂養10周后，伴隨著體質量的增加，HFD組小鼠的肝臟組織切片呈現出明顯的細胞空泡化現象。兩組小鼠的生育力參數分析的結果顯示，HFD組小鼠的精子活動力、前向運動精子百分數明顯降低，這與我們之前的研究一致[19]。同時睪丸形態學分析顯示，肥胖小鼠睪丸生精上皮中，生精細胞排列松散，生精細胞與支持細胞的黏附減弱，表明生精過程受到干擾。需要指出的是，我們的實驗中，雖然肥胖小鼠精子的活動力和前向運動精子百分數明顯降低，但兩組小鼠的精子濃度卻沒有顯著差異。我們推測主要原因是，雖然生精上皮結構紊亂，但還是具有各級生精細胞，可以產生精子。為了進一步探究肥胖損傷雄性精子活動力的機制是否與精子尾部中段的線粒體異常有關，我們隨后分析了精子的線粒體數量和功能是否發生了改變。

線粒體是由外膜和內膜組成的具有雙層膜結構的細胞器，鑲嵌在內膜上的氧化呼吸鏈（Electron transport chain,ETC）是ATP產生的重要基礎，且維持著線粒體內部較高的負極線粒體膜電位 （Mitochondrial membrane potential,Δψ）。膜電位的維持對于線粒體功能至關重要，膜電位降低會對呼吸鏈上各因子的氧化還原狀態，膜間隙的離子和代謝物的分布規律產生負面影響，從而影響線粒體正常的生理功能。因此，線粒體膜電位的大小被認為是線粒體“健康”指標[20]。而線粒體膜電位可以作為一個更為靈敏的數據來評估精子的質量[21]。通過檢測線粒體膜電位來推斷線粒體功能可作為男性生育力檢查的一個重要指標。有研究表明，精子線粒體膜電位的降低會導致精子活動力和受精能力的下降[22]。另一方面，mtDNA的拷貝數異常也會影響雄性的生殖功能[23]。Gyun等[24]比較了正常男性和弱精男性的精子mtDNA拷貝數后發現，精液異常的患者與正常男性相比，其精子mtDNA拷貝數增加，但是mtDNA的完整性顯著降低。小鼠實驗表明，睪丸的mtDNA拷貝數降低會導致精母細胞和精子畸變，而增加mtDNA拷貝數能夠在一定程度上恢復睪丸的部分功能[25]。

本研究同時對兩組小鼠精子線粒體的膜電位和mtDNA拷貝數進行了檢測分析。利用兩種染液對精子線粒體進行染色，隨后經流式細胞儀分析精子染色后的平均熒光強度以表示精子線粒體膜電位的大小。熒光探針法是研究線粒體膜電位最常用的方法之一。當前廣泛使用的探針分為兩類：一類是熒光強度探針，較常使用的是羅丹明123、四甲基羅丹明甲酯等[26]。該類型探針在線粒體膜電位正常的情況下會在線粒體內引起強烈的聚集而發生熒光淬滅（aggregation-caused quenching,ACQ），發出微弱的熒光。當線粒體膜電位降低時，一部分探針進入細胞，這時線粒體內的探針濃度較低而發出更強的熒光，但該類探針的局限性在于無法準確地判斷膜電位是消失還是降低。另一類探針是雙色熒光探針，常用的是JC-1探針[27]，這類探針在線粒體膜電位高時呈現聚集的狀態而發出紅色的熒光，在膜電位低時以單體的形式存在而發出綠色的熒光。通過熒光的顏色變化可判斷膜電位的變化趨勢，通常用紅色和綠色平均熒光強度的比值來表示載有JC-1的細胞線粒體的膜電位[28]。因此，JC-1是研究線粒體膜電位使用最廣泛的熒光指示劑。目前，已有很多研究運用探針檢測精子線粒體膜電位[29]。與熒光探針染色相匹配的測定方法是流式細胞術，它能夠用于評估精子活動力、頂體完整性、獲能狀態、DNA狀態、線粒體功能等。與傳統地使用顯微鏡觀察精子相比，流式細胞術最大的一個特點就是能夠在短時間內對大量的精子進行分析。這也使得流式細胞術能夠非常靈敏地發現各種精子之間的細微差別，同時也是流式細胞術與其他檢測儀器相比的最大優點。通過對精子進行染色且經流式細胞術檢測可以很好地觀察精子的形態及其各組分的功能。因此，流式細胞術被廣泛用于測定精子線粒體的膜電位[30]。

在本項研究中，我們同時運用JC-1和羅丹明123對正常和肥胖小鼠的精子進行染色以保證實驗結果的可靠性。使用JC-1對兩組小鼠精子進行染色，隨后分別比較了正常組和肥胖組小鼠精子染色后發出的紅光與綠光平均熒光強度的比值。結果顯示，肥胖組相比于正常組，其比值明顯降低，這表明在肥胖組小鼠精子中JC-1多以單體的形式存在，線粒體的膜電位明顯降低而線粒體功能受損。同時，羅丹明123對正常和肥胖小鼠精子染色的結果顯示，肥胖組平均熒光強度明顯高于正常組，由于熒光強度與膜電位成反比，這表明肥胖組小鼠的精子線粒體膜電位與正常組相比明顯降低，該結果與我們使用JC-1染色的結果高度一致。與此同時，我們對兩組小鼠精子的mtDNA拷貝數進行了檢測，結果顯示兩者沒有統計學差異，這表明這兩組小鼠精子線粒體數量并沒有差異，而線粒體的功能卻明顯受損。

我們的研究結果證明，肥胖的確能夠引起精子活動力和前向運動精子百分數的減弱，盡管肥胖個體的睪丸形態結構異常，但還是能夠產生精子；肥胖小鼠精子線粒體數量無明顯的變化，但膜電位卻明顯下降，這提示其精子線粒體功能紊亂。因此，本研究進一步證實了肥胖小鼠精子線粒體膜電位下降可能是其活動力和前向運動精子百分數減弱的重要原因之一。