葆生精改善少弱精子癥模型大鼠生殖功能的實驗研究

張 哲 金滋潤 楊宇卓 張海濤1, 祝雨田1, 張洪亮,5 毛加明

劉德風2 趙連明1,2 唐文豪1,2,5 林浩成1,2 洪 鍇1,2 邢國剛3,4,* 姜 輝1,2,5,*

1．北京大學第三醫院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大學第三醫院男科；3.北京大學神經科學研究所；4.北京大學基礎醫學院神經生物系；5.北京大學第三醫院精子庫

近年來隨著環境污染的加劇、生活節奏的加快和生育年齡的延遲，不育癥的發病率逐年升高，已經成為了一個重大公共健康問題[1,2]。全球約有10%～15%的育齡期夫婦受到不育癥的困擾，其中男性因素占不育原因的一半左右[3]。少弱精子癥是導致男性不育的主要原因之一，目前雖然針對少弱精子癥的藥物治療取得了一定進展，但仍有部分患者的療效不盡人意[4]。本研究擬通過生殖毒性藥物奧硝唑（ornidazole,ORN）建立少弱精子癥大鼠模型，觀察葆生精對少弱精子癥模型大鼠生殖功能的影響，探索葆生精治療少弱精子癥的機制，為臨床男性不育的藥物治療提供理論基礎。

材料與方法

一、試劑與儀器

奧硝唑（ORN，貨號：MB1173，大連美侖生物技術有限公司），羧甲基纖維素鈉（貨號：30036365，國藥集團化學試劑有限公司），0.9%氯化鈉注射液（NS，石家莊四藥有限公司），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（貨號：A005,南京建成生物科學研究所）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（貨號：S0109,碧云天生物技術有限公司），抗Bcl-2兔多克隆抗體 （貨號：bs-4563R，Bioss）、抗Caspase3兔多克隆抗體 （貨號：bs-0081R，Bioss），精子計數板（南寧松景天倫生物科技有限公司），水浴鍋（北京市長風儀器有限公司），計算機輔助精子分析系統 （北京偉力新世紀科技發展有限公司，型號：WLJY-9000）。 普通光學顯微鏡（Olympus），臺式冷凍離心機（型號：5417R，eppendorf）。

二、動物分組與實驗

34只健康成年雄性SD大鼠，體質量200～230g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（京）2006-0008。將大鼠按體質量隨機分為溶劑對照組（vehicle）7 只、少弱精子癥模型組（ORN）8 只，生理鹽水對照模型組 （ORN+NS）9只和葆生精治療模型組（ORN+BSJ）10只。適應性飼養1周。大鼠均自由采食、飲水，飼養過程中，每天換水，隔日換籠中的墊料以保持清潔干燥。環境溫度20～25℃，光照:白天12 h/夜晚 12 h。 （1）ORN 組：奧硝唑溶液灌胃， 400mg/（kg·d），連續灌胃至治療結束[5]。（2）vehicle組：給與等體積的0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。奧硝唑溶液制備：0.25g奧硝唑加入1 mL 0.2%羧甲基纖維素鈉溶液 （0.2g羧甲基纖維素鈉加入100 mL滅菌的雙蒸水，同時加入兩滴100μLTween-20）置于干凈研缽中研碎至糊狀。以快速前向運動的a級精子數和慢速前向運動的b級精子數之和小于50%，或快速前向運動的a級精子數小于25%作 為 造 模 成 功 的標準。（3）ORN+BSJ組：從奧硝唑灌胃的第15天開始，給與大鼠沙棘汁灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+BSJ 514 mg/（kg·d）。 （4）ORN+NS 組：從奧硝唑灌胃的第15天開始，給與大鼠生理鹽水灌胃，ORN 400 mg/（kg·d）+ 等體積 NS。大鼠每日稱量，藥物現用現配，每日一次，連續3周。

三、標本采集與精子活力檢測

各組大鼠在治療結束后1 d腹腔注射過量水合氯醛處死，應用擴散法收集附睪尾精子進行精子活力分析實驗[6]。將雙側附睪尾部放入標記好的含2 mL（37℃預熱）0.9%氯化鈉溶液的一次性培養皿中，用小剪刀在附睪尾部，輕輕地剪3刀，37℃水浴鍋中放置2 min，輕輕混勻，取20 μL加到37℃預熱的精子計數板上，選取6個視野，于2 min內完成測試。運用計算機輔助精子分析系統檢測主要測試指標：精子密度、精子活力、a級精子比例、（a+b）級精子比例、曲線運動速度(VCL)、直線運動速度(VSL)、平均路徑速度(VAP)、直線性(LIN)、前向性(STR)、精子頭側擺幅度(ALH)。

四、大鼠睪丸組織勻漿GSH-Px及SOD活性測定

取1側睪丸組織按質量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的勻漿介質(PBS)，冰水浴條件下剪碎組織后一起加入勻漿管中。將玻璃勻漿管置于冰水浴條件下，手動勻漿，30 s/次，重復6～8次，制成10%的勻漿液，4℃、2 500×g離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書操作方法測定GSH-Px和SOD活性。

五、大鼠睪丸組織中4-HNE、Bcl-2、Caspase3蛋白表達檢測

取1側睪丸組織按質量(g)：體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的RIPA裂解液，用勻漿器將組織充分研磨成不可見顆粒，冰上裂解1 h；然后將組織勻漿液離心 12 000×g，4 ℃，10 min， 取上清。 用 BCA(bicinchoninic acid)蛋白質測定試劑盒(美國Pierece公司)進行蛋白定量，在Model680酶標儀 （美國BIO·RAD公司）上讀板，測量波長為570 nm；以標準品濃度為橫坐標，校正吸光度為縱坐標作標準曲線。按照標準曲線計算出蛋白濃度。將蛋白加入10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，將分離出的蛋白100V恒壓轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。完畢，將有蛋白的PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉I h。取出封閉好的PVDF膜孵育相應一抗，4℃冰箱孵育過夜。第2天，取出一抗反應結束的PVDF膜，TBST洗3次，室溫孵育相應二抗1 h。結合二抗后的PVDF膜用TBST洗3次后顯色觀察蛋白表達的含量變化。之后采用Quantity One軟件統計蛋白灰度。

六、大鼠睪丸組織形態學檢測

將睪丸組織于4%溶液中固定24 h后，20%蔗糖脫水，依次用乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，5 μm厚切片，二甲苯和酒精梯度脫蠟，蘇木素和伊紅染色，脫水，透明，樹膠封片，置于光鏡下觀察玻片。

七、統計學分析

各組實驗數據采用Prism7.0統計軟件進行分析，符合正態分布的數據，以均數±標準誤（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析，及Bonferroni post-hoc檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、葆生精可顯著改善少弱精子癥模型大鼠的精子質量

與正常對照組相比，模型大鼠附睪精子質量，包括精子密度、活力和直線速率、曲線速率等運動參數都明顯下降（P＜0.01），說明成功構建了少弱精子癥大鼠模型。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠附睪精子的各項指標均有顯著改善，精子活力、精子密度及運動參數都有明顯的增加（見表1及表2）。

二、大鼠睪丸組織形態學變化

由圖1可以看出，正常對照組大鼠睪丸組織中各級生精細胞排列整齊，生精小管基底膜完整，管腔內充滿精子;少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織中部分生精細胞脫落，層次排列紊亂，生精上皮細胞變薄，管腔內精子數量明顯減少。給予葆生精治療后，雖然各級生精細胞排列略稀疏，但生精上皮形態基本恢復，各級生精細胞及管腔內精子數目都有明顯增加。

三、葆生精可改善少弱精子癥大鼠睪丸中的氧化應激狀態

與正常對照組相比，模型大鼠睪丸組織中SOD的酶活力和GSH-Px的酶活力都明顯下降（P＜0.01），而給予葆生精治療后，大鼠睪丸組織中SOD的酶活力及GSH-Px的酶活力則都較對照組有明顯的增加（P＜0.01）。見表3。

四、葆生精可減少少弱精子癥大鼠的生精細胞凋亡

如圖2所示，與正常對照組相比，模型大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有所下降，葆生精治療模型組（ORN+BJS組）大鼠睪丸組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯增加（P＜0.01）。同時我們觀察到少弱精子癥模型組大鼠睪丸組織凋亡蛋白Caspase-3的表達明顯增加 （P＜0.05），給予葆生精治療后大鼠凋亡蛋白Caspase-3 的表達明顯下降（P＜0.05）。

表1 葆生精對少弱精子癥模型大鼠精子活力及密度的影響

表2 葆生精對少弱精子癥模型大鼠精子運動參數的影響

表3 各組大鼠睪丸組織抗氧化應激酶活性的比較

圖1 各組大鼠睪丸組織形態學改變（HE:×200）

圖2 各組大鼠睪丸組織中Bcl-2及Caspase-3的蛋白表達

討 論

少弱精子癥的發病原因十分復雜，如精索靜脈曲張、內分泌調節異常和不良生活習慣等均可引起精子的數量減少和活力減弱[7,8]。多項流行病學調查統計均發現少弱精子癥約占男性不育的一半以上，少弱精子癥一直是男性不育治療的重點和熱點。構建合適的少弱精子癥動物模型，可用于少弱精子癥新的治療方法和作用機制的探索。奧硝唑（ORN）是一種硝基咪唑類厭氧菌抗生素，臨床上主要應用于預防和治療脆弱擬桿菌、狄氏擬桿菌等敏感厭氧菌所引起的多種感染性疾病，但同時發現ORN對生殖系統有一定的毒性作用。研究發現低劑量的ORN能可逆性地抑制大鼠附睪精子活力，高劑量的ORN可破壞睪丸的生精功能，精子密度和活力均顯著下降，其病理變化接近男性不育患者的臨床特征[9,10]。本研究中少弱精子癥模型大鼠睪丸生精細胞脫落，層次排列紊亂，管腔內精子數量明顯減少，其造模效果與之前研究相似，說明少弱精子癥模型制備成功。

氧化還原系統動態平衡調控對精子發生和男性生育力維持具有重要的調控作用[11]。精原干細胞的自我更新需要活性氧（reactive oxygen species，ROS）來維持，二倍體的精原細胞分化為單倍體精子細胞的過程也需要一定濃度的ROS。睪丸中細胞分裂活躍，且酶類調控系統復雜，位于線粒體嵴的呼吸鏈氧化磷酸化酶復合體，如黃嘌呤、NADPH氧化酶、細胞色素P450等多種途徑均可產生ROS，這就意味著線粒體氧消耗和ROS產生速率均較高；且睪丸中富含非飽和脂肪酸易受ROS的攻擊而導致功能損傷[12,13]。為了防止ROS產生過多所帶來的損傷效應，睪丸中具有包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在內的多種抗氧化酶系統和抗氧化小分子。但如果ROS產生過多超過了睪丸的抗氧化能力時，睪丸就會處于氧化應激狀態，導致組織細胞內線粒體崩解脫落、膜脂質過氧化等，損害細胞的正常生理功能[14,15]。越來越多的研究表明氧化應激損傷在男性不育的發病過程中起著重要作用，在臨床上使用維生素E、左卡尼丁等抗氧化劑治療男性不育也取得了一定療效[16-18]。

葆生精是一種新型的天然多元小分子營養素，主要成分蔓越莓和沙棘具有抗炎、抗氧化作用。葆生精經微生物復合發酵工藝獲取多組分抗氧化營養素，克服了傳統抗氧化劑單組分或多組分簡單疊加無法全面平衡人體復雜結構性氧化應激的技術瓶頸；其特有的網絡抗氧化能力，經機體代謝途徑可直接清除體內多種過量氧自由基，并同步抑制其鏈式反應。臨床研究初步發現葆生精可改善男性不育患者的精液質量，但其具體的分子機制仍尚未完全闡明。我們通過構建大鼠少弱精子癥動物模型發現，ORN可通過降低抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，誘導生精細胞凋亡并嚴重損傷大鼠的精子質量。SOD是催化超氧化物歧化反應的金屬酶，通過將超氧化物轉化為破壞性較弱的分子氧和過氧化氫以消除ROS引起的氧化損傷；GSH-Px是體內分解過氧化物的主要酶類，對過氧化氫具有較強的清除能力[19]。給予葆生精治療后，少弱精子癥大鼠睪丸內SOD和GSH-Px的酶活力明顯增加，說明葆生精可增加大鼠生殖系統的抗氧化能力。我們進一步觀察到睪丸組織中凋亡蛋白Caspase-3的表達下降而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達量明顯增加，在睪丸組織形態學上我們也能觀察到大鼠生精小管管腔內的生精細胞和精子數目也都有所恢復，同時使用葆生精治療組大鼠附睪的精子數目和活力也得到了明顯提升。

綜上所述，葆生精可通過提高少弱精子癥模型大鼠的抗氧化能力，修復生殖系統的氧化損傷，抑制生精細胞凋亡，從而提高精子濃度和活力。本研究結果表明，葆生精對生育力受損的少弱精子癥大鼠模型有明顯的生殖保護作用，對臨床少弱精子癥患者的治療具有一定的參考價值。但本研究未觀察不同藥物劑量的治療效果，葆生精發揮生殖保護作用的具體機制不夠詳盡，仍需進一步研究探索。