醋糟固態厭氧消化特性及微生物群落結構分析

張周，張雅晶，周云龍，許之揚,3，施萬勝，阮文權*

1(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫，214122)2(無錫市太湖湖泊治理股份有限公司，江蘇 無錫，214062) 3(江蘇晨潔再生資源科技有限公司，江蘇 張家港，215600)

醋糟是食醋生產過程中的主要廢棄物，主要成分為木質纖維素、粗蛋白質、糖類以及微量的脂類物質，屬于食品加工行業廢棄物[1]。醋糟具有產量大、酸性大、含水率高等特點，我國醋糟年產量高達300萬t，且仍以7%的速度增長，若處理不當會導致嚴重的環境問題[2]。現階段醋糟常規的處理方式有焚燒、填埋、堆肥、飼料化、培養基質等，處理能力有限，經濟效益不高，且容易造成二次污染等問題[3]。厭氧消化是醋糟等有機廢棄物綜合處理的有效方式之一，能夠將糖類、纖維素、蛋白質和脂肪等結構復雜的大分子物質轉化成沼氣，在規模化處理同時，實現資源化利用[4]。周冠男等[5]在中溫條件下將醋糟與豬糞、雞糞混合厭氧發酵，醋糟與豬糞、雞糞揮發性固體(volatile solid, VS)質量比均為1∶3條件下，累積甲烷(CH4)產量分別為286.51、312.57 mL/g VS。但醋糟中木質纖維素高度復雜和穩定的交聯結構，導致厭氧消化水解速率受限。為了提高木質纖維素的利用效率，通常采用酸堿浸泡、水熱處理等手段對醋糟進行預處理。WANG等[6]采用10種不同方式對醋糟進行預處理，顯示經堿性H2O2預處理醋糟CH4產率提升51.7%。師楊蕾等[7]采用H2O2對醋糟進行預處理，H2O2含量、溫度和預處理時間分別為4%、40 ℃和12 h條件下，累積CH4產量達302.0 mL/g，較未預處理組提升了54.4%。在實際處理過程中，預處理技術存在成本高，難以規模化應用。因此，如何構建高效的厭氧消化體系，強化醋糟中木質纖維素水解，全面解析厭氧消化過程中微生物群落結構及演替規律成為研究熱點。

本研究采用全混式反應器構建醋糟高固態連續式厭氧消化體系，逐步提高系統有機負荷(organic loading rate, OLR)[2.01～7.11 g/(L·d)]，馴化出高效的木質纖維素降解菌群，強化系統厭氧消化功能。通過分析產CH4性能和中間代謝產物，掌握不同OLR條件下醋糟降解及轉化規律。同時采用高通量測序技術對發酵體系的微生物群落結構及演替規律進行解析，為掌握醋糟厭氧降解過程及其微生物群落多樣性奠定基礎，對醋糟厭氧消化工程化應用具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

厭氧發酵底物醋糟取自江蘇鎮江某食醋生產企業，主要包含稻殼類填充物和釀醋原料殘渣。接種物取自實驗室餐廚垃圾厭氧反應器，底物和接種物主要參數如表1所示。

表1 底物和接種物性質Table 1 Characteristics of substrates and inoculum

1.2 試驗裝置

試驗裝置為自制臥式反應器，容積為10 L，有效容積為8 L，通過電伴熱保持溫度在(37±1) ℃，攪拌電機、溫度探頭、電加熱系統、氣體流量計、回流泵等均通過控制系統進行調控。醋糟從反應器頂部進料口加入到反應器中，經發酵反應后沼渣從反應器底部出料口取出，沼渣經板框壓濾固液分離后，沼液部分回流至臥式反應器中(圖1)。發酵產生的沼氣經氣體收集裝置收集后進行成分分析。

圖1 試驗裝置圖Fig.1 Diagram of experimental equipment

1.3 試驗設計

試驗開始前向反應器裝入接種污泥至工作體積并進行預培養，以去除所有殘留底物。反應器總運行時間為170 d，通過逐步提高臥式反應器負荷的方式將整個試驗分為5個階段，分別為1～15 d、16～45 d、46～75 d、76～130 d、131～170 d，用編號I～V表述，對應物料OLR(以VS計)分別為2.01、3.98、5.16、6.06、7.11 g/(L·d)，物料停留時間分別為160、80、65、55、40 d。反應器運行期間，定時取樣檢測，通過指標分析反應器運行狀態，提供負荷提升依據，整個運行過程系統含固率保持在15%左右。

1.4 指標分析

總固體(total solid,TS)、VS和總氨氮(total ammonia nitrogen, TAN)采用標準方法分析[8]；總碳、總氮通過元素分析儀(Vario MICRO cube，德國Elementar)進行測定；揮發性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)采用氣相色譜(GC-2010 plus，島津)進行測定；沼氣成分采用便攜紅外沼氣分析儀(GAS-BOARD 3200L，武漢四方)進行測定；收集厭氧反應器每個OLR結束時的樣品，貯存于-80 ℃ 以備后續DNA提取和微生物群落分析。根據操作說明使用Powersoil?DNA提取試劑盒(MoBio，美國)提取DNA。分別使用細菌通用引物對338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、古菌通用引物對524F10extF(5′-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3′)和Arch958RmodR(5′-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3′)擴增16S rRNA基因，構建擴增文庫。在MiSeq平臺(Illumina公司，美國)進行測序，按照HU等[9]所述進行原始序列分析處理。

2 結果與分析

2.1 厭氧消化產氣性能分析

CH4產量是厭氧發酵的一個重要指標，反映當前發酵條件下物料的產CH4性能[10]。整個試驗階段反應器沼氣產量、CH4產量和CH4體積分數如圖2所示。從整體上看，階段I～V沼氣產量和CH4產量均出現先下降后升高再降低的過程，在階段IV中CH4產量和沼氣產量均達到最大值。5個階段穩定的沼氣產量分別為453、396、371、423、366 mL/g VS，對應的CH4產量分別為251、205、199、226、182 mL/g VS，CH4的體積分數基本維持在44.17%～59.39%。李倩等[11]研究不同OLR條件下醋糟厭氧消化，單位質量底物沼氣和CH4產量均與本結果基本一致。分階段來看，在調整OLR初期，負荷提升對系統造成一定的沖擊，系統產甲烷性能受到影響，沼氣產量和CH4產量均出現突然降低的現象，隨著反應的進行，產CH4性能逐漸恢復至穩定狀態。第Ⅱ～Ⅳ階段運行至沼氣產量穩定所需的時間分別為5、9、24 d，表明隨著OLR的提升，系統所需的適應期逐漸增加。在階段Ⅱ中沼氣產量和CH4產量出現較大波動，23～26 d CH4產量從420 mL/g VS迅速降低至287 mL/g VS，及時調整沼液回流比，使體系中產甲烷菌活性得以快速恢復[12]。第V階段OLR提升至7.11 g/(L·d)時，沼氣產量和CH4產量均低于階段IV，且隨著反應器運行并未上升，說明該狀態下產甲烷性能受到抑制，OLR已超出發酵體系處理極限。戴小虎等[13]研究不同OLR對醋糟厭氧消化性能影響，當OLR>3.56 g/(L·d)時，反應體系出現明顯酸化，產CH4活性被嚴重抑制。CHEN等[14]研究OLR對醋渣厭氧消化過程穩定性及微生物群落組成的影響，研究表明最適OLR為2.0 g/(L·d)，當OLR升高至2.5 g/(L·d)會導致厭氧消化過程出現不可逆抑制。本研究利用全混臥式反應器處理醋糟，在高OLR條件下，沼氣產量和CH4產率分別達423、226 mL/g，均優于上述研究。

圖2 產甲烷性能變化情況Fig.2 Variations of methane characteristics during methane production performance experiment

2.2 系統穩定性分析

VFAs和TAN是厭氧發酵過程重要的中間產物，VFAs也是產甲烷菌利用的重要底物，當系統VFAs質量濃度過量累積時，產甲烷菌活性受到抑制，對系統穩定性產生影響。整個運行過程系統TAN和VFAs質量濃度如圖3所示。TAN質量濃度在1.53～2.99 g/L波動，整體呈現第Ⅰ和Ⅱ階段高于其他階段，在前30 d TAN質量濃度維持在較高水平，在第25天達到最大值2.99 g/L。VFAs質量濃度在階段I～IV均呈現出先上升后下降，最后保持穩定的趨勢。增加系統OLR初期時，一方面體系內有機物水解酸化，快速產生有機酸，另一方面，OLR提升導致產甲烷菌活性降低，VFAs產生累積[15]。VFAs質量濃度在前27 d持續上升，最高達11.41 g/L。有研究表明，發酵體系內VFAs質量濃度超過10 g/L時，會導致pH降低，產甲烷菌活性受到抑制[16]。為避免系統進一步惡化，及時調整沼液回流比從100%降至75%，以消除氨氮的持續積累，降低系統TAN和VFAs質量濃度，解除抑制現象。系統穩定運行后VFAs質量濃度基本維持在9 g/L左右，未發生酸抑制現象。隨著OLR提升至7.11 g/(L·d)，VFAs質量濃度在8.94～13.47 g/L產生明顯波動，系統穩定性被破壞，產甲烷菌不能穩定利用VFAs，導致VFAs質量濃度波動，CH4產率降低等現象。

圖3 TAN和VFAs濃度變化Fig.3 Changes in TAN and VFAs concentrations

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 微生物群落多樣性

為了解醋糟厭氧消化微生物群落結構，采用高通量測序技術解析不同OLR條件下的反應體系。細菌和古菌豐富度多樣性指數如表2所示，所有樣品Coverage指數均>99%，表明測序深度基本可反映樣品中絕大多數細菌和古菌的真實情況。分析代表微生物豐富度的Chao1和Ace指數可知，階段I～IV細菌群落豐富度隨著OLR增加出現先下降后上升的過程，階段IV樣品中Chao1和Ace指數最高，說明群落豐富度最高。相對細菌而言，古菌豐度較低，同時隨著反應進行系統古菌豐度逐漸降低。分析表征微生物多樣性的Shannon和Simpson指數可知，在前4個階段細菌群落多樣性同樣經歷先下降后上升的過程，反應器運行過程中操作參數的優化使得與醋糟降解相關的微生物得到保留和增殖，而與醋糟降解無關的微生物則被淘汰。古菌多樣性與細菌呈現基本相同的趨勢。在厭氧發酵體系中，微生物群落多樣性越高，產沼氣性能越好[17]。然而，過高的OLR引起了階段V微生物群落多樣性的顯著降低，底物水解效率降低，產沼氣性能變差，這與2.1研究結果一致。

表2 細菌和古菌多樣性分析結果Table 2 Diversity analysis of bacterial and archaeal communities

2.3.2 細菌群落結構變化

厭氧消化水解過程是通過多種微生物共同完成，而富含木質纖維素的醋糟產CH4性能高度依賴于水解過程，因此，系統細菌群落的組成及相對豐度將在水解代謝過程中起到決定性作用。各運行階段細菌在門和屬水平上的群落結構如圖4所示。圖4-a顯示在門分類水平上，系統中細菌主要是擬桿菌門Bacteroidetes,45.6%～95.5%)和厚壁菌門(Firmicutes,4.38%～53.1%)，Firmicutes是水解酸化階段的主要菌群，能夠對醋糟等有機物進行水解；Bacteroidetes是富氮底物厭氧發酵的關鍵菌，能夠加速分解醋糟中不易降解的有機物[18]。整個運行階段這2種細菌相對豐度之和均達98%以上，但不同運行階段Bacteroidetes和Firmicutes相對豐度占比有一定差異。階段Ⅱ中Firmicutes相對豐度僅為4.38%，可能是由于大量的沼液回流使體系中TAN和VFAs濃度升高，系統群落結構發生變化，Firmicutes相對豐度迅速降低，導致水解過程受阻，厭氧消化受到抑制，系統CH4產量降低。隨著及時調整回流比，階段Ⅲ中Firmicutes相對豐度上升至27.8%，系統產CH4性能恢復。階段IV中Bacteroidetes和Firmicutes相對豐度最均衡，分別為45.6%和53.1%，此階段2種菌群協同作用，醋糟水解過程和產CH4性能最佳。

a-門水平細菌多樣性；b-屬水平細菌多樣性圖4 細菌在門和屬水平上群落結構Fig.4 Analysis of bacterial at the phylum and genus levels

2.3.3 古菌群落結構變化

a-門水平古菌多樣性；b-屬水平古菌多樣性圖5 古菌在門和屬水平上群落結構Fig.5 Analysis of archaeal diversities at the phylum and genus levels

不同OLR條件下系統古菌群落結構發生一定變化，但是不管在門水平還是屬水平上，古菌群落差異度明顯要低于細菌群落差異度。按照氫營養型產CH4途徑(Methanobacterium、Methanoculleus)和混合營養型產CH4途徑(Methanosarcina、Methanomassiliicoccus、Bathyarchaeota_norank)對古菌屬進行分類，具體分布情況如圖6所示。整個運行過程氫營養型古菌屬均占主導，相對豐度分別為66.0%、61.38%、71.11%、66.64%和93.50%，在前4個階段，氫營養型古菌屬和混合營養型古菌屬相對豐度保持穩定，相對豐度比例基本維持在2∶1，多樣的產CH4途徑表明醋糟各類型水解產物均能夠被有效利用。隨著OLR提升，第V階段氫營養型古菌屬相對豐度快速提升，混合營養型古菌屬相對豐度降低至6.46%，此時氫營養型產CH4途徑占絕對主導，混合營養型產CH4途徑受阻，影響脂肪酸的轉化和代謝，這也是影響第V階段CH4產率下降的重要因素。

圖6 各階段不同代謝途徑古菌屬分布情況Fig.6 Distribution of archaea genus in different metabolic pathways

3 結論

(1)全混式固態厭氧消化體系能夠對醋糟進行高效處理，OLR為6.06 g/(L·d)條件下表現出最佳的消化性能，沼氣產量和CH4產率分別達423、226 mL/g VS，進一步提升運行負荷，超出處理極限，系統產氣性能降低。

(2)整個運行過程中TAN質量濃度呈先上升后下降趨勢，穩定運行階段VFAs質量濃度基本維持在9 g/L左右，系統未發生酸抑制現象。在25 d左右時，TAN和VFAs質量濃度達到最大值分別為2.99、11.41 g/L，產甲烷活性受到抑制，及時調整沼液回流比，系統快速恢復。

(3)細菌門水平上主要以擬桿菌門(Bacteroidetes，45.6%～95.5%)和厚壁菌門(Firmicutes，4.38%～53.1%)為主，4種與木質纖維素代謝有關的菌屬相對豐度從第I階段的23.09%提升至第IV階段的50.04%，有利于形成各種代謝途徑促進底物高效水解，表現出最佳產氣性能。

(4)氫營養型產甲烷途徑在醋糟固態厭氧發酵體系內占主導，前4個階段，氫營養型古菌屬和混合營養型古菌屬相對豐度比例基本維持在2∶1，各類型水解產物均能被體系中多樣的產CH4途徑利用。