冬凌草毛狀根體系的建立

張利軍 宋小鋒 朱畇昊

[摘 要]用發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株對(duì)冬凌草無菌幼苗的葉片、莖段進(jìn)行侵染，而后通過共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)其產(chǎn)生冬凌草毛狀根，從而建立有效的冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系。通過PCR進(jìn)一步檢測(cè)T-DNA是否成功導(dǎo)入冬凌草毛狀根中。通過用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株對(duì)冬凌草外植體進(jìn)行侵染，能夠成功誘導(dǎo)產(chǎn)生冬凌草毛狀根，從而對(duì)冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系進(jìn)行建立，在一定程度上為冬凌草毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]冬凌草;毛狀根;發(fā)根農(nóng)桿菌;PCR

[中圖分類號(hào)]S567.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

冬凌草（Rabdosia rubescens）在清熱解毒、健胃活血、消炎止痛及抗腫瘤方面具有很好的功效。冬凌草次生代謝產(chǎn)物主要包括有萜類、甾體類、揮發(fā)油及黃酮類化合物。其在抗腫瘤方面具有很好的作用，而且在進(jìn)行的相關(guān)毒性實(shí)驗(yàn)測(cè)定中發(fā)現(xiàn)其并沒有明顯的毒性，這就使得其所具有的潛在藥用價(jià)值被國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者所關(guān)注。

毛狀根培養(yǎng)因具有使得植物快速生長(zhǎng)、對(duì)外源植物激素沒有依賴性等特點(diǎn)被眾多學(xué)者所青睞。利用植物組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)不僅可以在一定程度上人為地對(duì)生產(chǎn)進(jìn)度進(jìn)行控制，使得生產(chǎn)過程不受環(huán)境的制約，而且能夠在一定程度上對(duì)目的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量進(jìn)行大規(guī)模的提高。因此，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)冬凌草毛狀根體系進(jìn)行建立從而在一定程度上提高冬凌草次生代謝產(chǎn)物的生物合成量，這對(duì)于冬凌草藥用價(jià)值的研究具有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冬凌草植株采集自濟(jì)源冬凌草種植基地，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1、ACCC10060、ATCC15834菌株均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑與儀器

新型植物基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker， Taq Mix（康為世紀(jì)），頭孢噻肟鈉（歐意藥業(yè)），分光光度計(jì)（上海翱藝），電泳儀（BIO-RAD），分析天平（上海申安）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的活化與培養(yǎng)

分別取200μL于-80℃條件下保存的菌株ATCC15834、C58C1、ACCC10060，將其加入到已配制好的20mlYEB 液體培養(yǎng)基中，隨后在27℃黑暗條件下對(duì)其進(jìn)行200 rpm的快速振蕩培養(yǎng)，待培養(yǎng)一段時(shí)間后對(duì)菌液OD600值進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)其數(shù)值在0.3左右時(shí)以等體積的量向培養(yǎng)基中加入100μmol·L-1的乙酰基丁香酮（AS），隨后對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行繼續(xù)振蕩，待菌液的OD600值培養(yǎng)至0.6左右時(shí)，停止振蕩培養(yǎng)。在27℃條件下以4000 rpm的轉(zhuǎn)速對(duì)菌液進(jìn)行10 min的離心，離心過后將上清液倒掉保留沉淀，隨即以同等體積的量加入MS液體培養(yǎng)基和100μmol·L-1的AS混合液對(duì)菌體進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，繼續(xù)活化30min后轉(zhuǎn)化。

2.2 冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)與除菌

將培育良好的幼嫩冬凌草無菌苗葉片于無菌操作臺(tái)上進(jìn)行均勻的剪切，隨后將其分別接種于不含有激素的MS固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行3-5天的預(yù)培養(yǎng)。待預(yù)培養(yǎng)結(jié)束，于無菌操作臺(tái)上取出幼嫩的外植體葉片，并用無菌針在其葉片上進(jìn)行扎口，隨后將扎口后的葉片放入到已經(jīng)活化好的上述菌液中，侵染15min，侵染過后將葉片從菌液中取出并通過無菌濾紙將葉片上剩余的菌液進(jìn)行吸干，然后將其接種在含有100 μmol·L-1AS的MS固體培養(yǎng)基中，并于25.0℃培養(yǎng)條件下進(jìn)行4d的共培養(yǎng)。

待共培養(yǎng)結(jié)束后，取出外植體并用無菌濾紙將其附帶水分進(jìn)行吸干，隨后將外植體接種到含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉的除菌MS固體培養(yǎng)基上，并將其置于25℃的環(huán)境中進(jìn)行暗培養(yǎng)，以促使其能夠發(fā)根。培養(yǎng)過程中，每隔10d將其轉(zhuǎn)入到新鮮的含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉同種培養(yǎng)基中，直到外植體長(zhǎng)出毛狀根。

在培養(yǎng)過程中，當(dāng)毛狀根的長(zhǎng)度達(dá)到1-2cm左右時(shí)，將毛狀根用無菌剪刀剪下并將其接種到含有500mg·L-1的頭孢噻肟鈉的1/2 MS除菌固體培養(yǎng)基上。每隔7d 繼代培養(yǎng)一次，如此重復(fù)3-4次，其間并不斷降低除菌培養(yǎng)基中頭孢噻肟鈉（Cef）的含量，直至最后Cef的含量為零。

2.3 冬凌草毛狀根誘導(dǎo)的條件優(yōu)化

2.3.1 菌株類型：實(shí)驗(yàn)所用到的菌株分別為發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1、ATCC15834、ACCC10060菌株。

2.3.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2d、3d、4d。

2.4 冬凌草毛狀根的PCR檢測(cè)

冬凌草毛狀根及葉片的roLB和roLC基因的PCR檢測(cè)。冬凌草毛狀根DNA提取按照DNA提取試劑盒操作。通過建立20μL的PCR反應(yīng)體系對(duì)冬凌草毛狀根及葉片的roLB和roLC基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。待擴(kuò)增反應(yīng)完成后，用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，待電泳完成后進(jìn)行觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 毛狀根的誘導(dǎo)

誘導(dǎo)用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060、ATCC15834、C58C1對(duì)預(yù)處理的冬凌草葉片進(jìn)行侵染能夠使得冬凌草葉片被成功誘導(dǎo)產(chǎn)生冬凌草毛狀根。對(duì)其進(jìn)行大約10d的共培養(yǎng)，被侵染的冬凌草葉片與莖尖處開始產(chǎn)生黃白色的顆粒狀突起，而后突起的部位開始進(jìn)行發(fā)根，在此條件下產(chǎn)生的根具有明顯的向上或斜向上生長(zhǎng)的特性，沒有出現(xiàn)向地性，出現(xiàn)較多呈白色的根毛。

繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右，冬凌草毛狀根長(zhǎng)大并產(chǎn)生許多側(cè)根。將其轉(zhuǎn)接至除菌培養(yǎng)基3-4次進(jìn)行徹底的除菌，待除菌徹底后挑選出生長(zhǎng)旺盛、分支多的冬凌草毛狀根，隨后將此毛狀根接種在不含有外源激素的1/2 MS固體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)一段時(shí)間后毛狀根表現(xiàn)出較為良好的生長(zhǎng)狀況。

3.2 冬凌草毛狀根誘導(dǎo)的條件優(yōu)化

3.2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對(duì)冬凌草毛狀根誘導(dǎo)的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)根農(nóng)桿菌不同菌株類型對(duì)冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)如表1所示：

3.2.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)冬凌草毛狀根誘導(dǎo)的影響

實(shí)驗(yàn)過程中分別將2d、3d、4d設(shè)置為發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1對(duì)冬凌草葉片的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。其對(duì)冬凌草毛狀根誘導(dǎo)結(jié)果如表2所示：

3.3 冬凌草毛狀根的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖示中所標(biāo)注的7和8分別代表ATCC 15834菌株所誘導(dǎo)的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴(kuò)增出的特異性片段，條帶9和10則分別代表ACCC 10060菌株誘導(dǎo)的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴(kuò)增出的特異性片段，而條帶11和12表示C58C1菌株誘導(dǎo)的冬凌草毛狀根的rolB和rolC基因擴(kuò)增出的特異性片段，條帶大小均與目的基因大小一致;圖中標(biāo)注13和14的位置對(duì)應(yīng)為陰性對(duì)照的冬凌草幼嫩無菌苗的rolB、rolC基因擴(kuò)增出的特異性片段，實(shí)驗(yàn)過程中并未出現(xiàn)條帶。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000;1-6：作為陽性對(duì)照的ATCC15834、ACCC10060、C58C1菌株質(zhì)粒DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果;7-12：不同菌株誘導(dǎo)的毛狀根單克隆的DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果;13-14：作為陰性對(duì)照的冬凌草無菌苗的DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。

4 結(jié)論與討論

不同的菌株對(duì)同一植物進(jìn)行侵染時(shí)，其對(duì)發(fā)根的誘導(dǎo)率可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)中，共選取三種不同的發(fā)根農(nóng)桿菌（ACCC10060、ATCC15834、C58C1）對(duì)冬凌草進(jìn)行侵染誘導(dǎo)，結(jié)果表明，在其他外部條件均相同的時(shí)候發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1的誘導(dǎo)率是最佳。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染誘導(dǎo)冬凌草具有影響作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冬凌草最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間是3d，該條件下不僅能夠使得冬凌草的發(fā)根誘導(dǎo)率高達(dá)68.8%，而且冬凌草的出根時(shí)間是較為早的、出根數(shù)量相對(duì)較多、生長(zhǎng)狀況方面也相對(duì)良好。我們認(rèn)為很大的原因可能是由于適當(dāng)?shù)念A(yù)處理時(shí)間能夠在一定程度上降低發(fā)根農(nóng)桿菌在侵染冬凌草的過程中對(duì)其造成的脅迫傷害，并且能夠在一定程度上使得要轉(zhuǎn)化的外植體細(xì)胞維持在適宜發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的生理狀態(tài)即感受狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所建立的有效的冬凌草毛狀根培養(yǎng)體系、冬凌草毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)體系，為使用對(duì)毛狀根生產(chǎn)冬凌草次生代謝產(chǎn)物的奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 左海軍，李丹，吳斌，等.冬凌草的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（04）.

[2] 王大海，姬志勤，魏少鵬，等.冬凌草中抑菌成分研究[J].農(nóng)藥，2010（06）.

[3] 張廣求，王伯初，段傳人，等.提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物含量的方法與技術(shù)[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（06）.

[4] 孫敏.藥用植物毛狀根培養(yǎng)與應(yīng)用[D].西南師范大學(xué)，2011.

[5] 孫際薇.茉莉酸甲酯對(duì)曼陀羅毛狀根的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響[D].西南大學(xué)，2014.

[6] 劉連旺，李先恩，張永清.藥用植物毛根狀研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015（03）.