白細胞介素-18基因多態性與漢族人群炎癥性腸病的相關性

郭茂東 丁進 胡敏鸝 沈敏瑾 吳珍萍 王群英*

炎癥性腸病（IBD）主要包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD），是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病因至今未明。近年來，有研究發現IBD患者腸黏膜與血清IL-18表達增加有關［1］，且血清IL-18表達水平與疾病的嚴重程度密切相關［2］。本研究擬在浙江漢族人群中探討IL-18基因（rs1946518和rs187238）2個SNP與IBD易感性的關系，為進一步揭示IBD遺傳免疫學機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2018年2月金華市中心醫院、金華市人民醫院消化內科門診和住院確診的UC患者96例，男54例，女42例；平均年齡（42.78±14.32）歲。其中吸煙者24例，不吸煙或已戒煙者72例。CD患者73例，男40例，女33例；平均年齡（41.02±13.74）歲。其中吸煙者19例，不吸煙或已戒煙者54例。IBD診斷標準根據中華醫學會消化病學分會2012年廣州會議制定的“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見”。依據結腸鏡表現將UC病變部位分為左半結腸炎（63例）和廣泛結腸炎（33例）。UC病情嚴重程度分為輕中度（67例）和重度（29例）。CD病變范圍分為回腸型（26例），結腸型（24例），回結腸型（23例），疾病行為分為非狹窄非穿透型（41例），狹窄型（11例），穿透型（21例）。同期在金華市中心醫院體檢中心收集體檢健康者114例為對照組，其中男65例，女49例；平均年齡（40.58±10.77）歲。吸煙者29例，不吸煙或已戒煙者85例。所有研究對象在入組前經各項實驗室檢查排除腸結核、感染性腸炎、缺血性結腸炎、腫瘤及哮喘、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病。UC組、CD組與對照組年齡、性別構成比及吸煙者比例比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。以上研究對象均為無血緣關系的浙江漢族人群。所有入選者均簽署知情同意書，本項目經浙江大學金華醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）DNA提取：取外周靜脈血約3ml，EDTA-Na2抗凝。用血液基因組DNA提取試劑盒提取全基因組DNA。置于-20℃冰箱凍存。（2）改良多重高溫連接酶檢測反應技術檢測IL-18（rs1946518、rs187238）基因多態性。①多重PCR獲取目的基因片段：PCR擴增引物由上海生物工程技術有限公司合成，序列如下：rs1946518（上游引物：5'CCCCTTCCTCCCAAGCTCAATA 3'； 下 游 物 ：5'CCCTCTCCCCAAGCTTACTTTCTG3'。rs187238（ 上 游引物：5' GAAGGTGGAGGGAGGAGACTGC3'；下游引物 ：5' GAAGGCACAGAGCCCCAACTTT3'。PCR 總 反應體系20μl，包含1x HotStarTaq緩沖液，3.0mmol/L Mg2+，0.3mmol/L dNTP，1U HotStarTaq 聚合酶，1μl模板DNA和1μl多重PCR引物（引物濃度：1mmol/L）。反應條件 ：95℃ 2min ；94℃ 20s，65℃ 40s（每個循環減0.5℃），72℃ 1.5min，共11個循環；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5min，共24個循環；72℃ 2min；置于4℃保存。②多重PCR產物純化：在10μl PCR產物中加入5U蝦堿性磷酸酶（SAP，美國Promega 公司）和2U核酸外切酶（Exo I，美國Epicentre公司），37℃溫浴1h，然后75℃滅活15min。③iMLDR連接反應：連接反應體系包含10x連接緩沖液1μl，純化后多重PCR產物2μl，雙蒸水6μl，高溫連接酶0.25μl，5'連接引物混合液（1μmol/L）0.4μl，3’連接引物混合液（2μmol/L）0.4μl，連接酶引物序列分別為（rs1946518：FG5' TTCCGCGTTCGGACTGATATGCCA CACGGATACCATCATTAGAATTTTCTG3’；FP5'TAATA ATTTTTACACTTTCTGCAACAGAAAGTAAGTT3'；FT5'T ACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCCACACGGATACCATCA TTAGAATTTTCTT3'）；rs187238：RC5'TGTTCGTGGGC CGGATTAGTGAGCCCCAACTTTTACGGAAGAACAC3'；RG5'TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTGAGCCCCAACTTT TACGGAAGAACAG3'；RP5'ATTTCATGAAAATAGTGA TATTACATTAAAAGAAGTACTCTTT 3'）。 連 接 反 應 條件：94℃ 1min，56℃ 4min，共38個循環；置于4℃保存。④基因型判讀：取0.5μl稀釋后的連接反應產物，與9μl甲酰胺、0.5μl內標混勻，95℃變性5min后用ABI 3730XL測序儀（美國ABI公司）測序。最后采用GeneMapper 4.1軟件（美國ABI公司）判讀基因型。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計數資料用χ2檢驗；計量資料用兩獨立樣本t檢驗。采用非條件Logistic回歸分析IL-18基因的2個SNP位點的等位基因和基因型頻率在UC組、CD組和對照組間的分布差異，以及2個SNP對UC和CD患者臨床病理特征的影響。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UC組、CD組和對照組間IL-18（rs1946518和rs187238）基因多態性的分布比較 對照組中IL-18（rs1946518和rs187238）兩個多態性位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.752、1.364，P=0.386、0.243）。將UC組和CD組分別與對照組比較，結果發現UC組中rs1946518位點純合子基因型（TT）頻率顯著低于對照組（16.67% vs.34.21%，P=0.005，OR=0.385，95%CI：0.198～0.745）；而上述兩個 SNP位點的等位基因和基因型頻率在CD組和對照組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 IL-18基因多態性在IBD患者和對照組之間的比較［頻次（%）］

2.2 IL-18（rs1946518和rs187238）基因多態性與IBD臨床病理特征的關系 采用非條件Logistic回歸分析IL-18各位點的等位基因和基因型頻率與UC、CD臨床病理特征的關系。納入回歸的因變量包括年齡、性別和吸煙，結果發現IL-18（rs1946518）位點的基因多態性與UC患者的病變部位有關（P＜0.05）。與廣泛結腸炎比較，遠端結腸炎患者中（rs1946518）位點基因型（GG+GT）頻率明顯升高（88.88% vs.72.73%，P=0.044，OR=3.00，95%CI：1.001～8.989）；而上述兩個位點的等位基因及基因型頻率分布在輕中度UC患者和重度UC患者間比較差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。在CD患者中，根據疾病行為和疾病部位進行分層分析，結果發現IL-18（rs1946518和rs187238）基因多態性與CD疾病行為及疾病部位均無關（P＞0.05）（見表3、4）。另外，Logistic回歸分析還發現IL-18基因上述各位點的等位基因和基因型頻率與UC、CD的年齡、性別及吸煙均差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 IL-18基因多態性與UC患者臨床病理特征的關系［頻次（%）］

表3 IL-18基因多態性與CD患者疾病行為的關系［頻次（%）］

3 討論

目前認為，rs1946518和rs187238定位于IL-18基因第二外顯子啟動子調控區域，是IL-8基因上最常見的2個功能性單核苷酸多態性位點，在調控IL-18蛋白轉錄表達中具有重要作用［3］。研究表明，rs187238位點G等位基因含有一潛在的組蛋白H4（H4TF-1）結合位點，當該位點發生G→C突變后將導致H4TF-1結合位點缺失，從而造成IL-18基因的表達活性降低［4］。而rs1946518位點發生的G→T突變后將直接導致轉錄因子cAMP 應答元件結合蛋白（CREB）去磷酸化，阻斷其與 DNA 片段上的 c AMP應答元件（CRE）結合，從而抑制 CRE 調控的IL-18基因表達［4］。Violetta 等在針對來自健康人群的單個核細胞研究結果發現rs1946518位點純合子TT基因型攜帶者血清IL-18蛋白表達水平顯著低于TG基因型及GG基因型個體。另一項來自下肢深靜脈血栓患者人群中的研究表明rs187238 GG基因型攜帶者血漿IL-18表達水平高于GC+CC基因型攜帶者［5］。

本資料結果顯示，IL-18（rs1946518和rs187238）2個SNP位點的等位基因和基因型頻率在對照組和CD組間分布差異均無統計學意義，表明IL-18基因多態性與浙江漢族人群CD的易感性無關。與對照組比較，UC組 IL-18（rs1946518）純合子基因型TT頻率顯著降低，提示rs1946518基因突變后降低UC的發病風險。這一結論與來自亞洲人群的Meta分析研究發現基本一致［6］。Ben等對突尼斯人群的研究表明盡管IL-18基因與CD無關，但rs187238純合子基因型GG攜帶者罹患UC的風險是其他基因型攜帶者的1.99倍［7］。而來自德國人群的研究卻表明rs187238基因多態性與UC的易感性無關［8］。在日本人群中，Takagawa等亦報道IL-18基因2個SNP與CD無關［9］。最近一項納入1930例CD和1930例對照的大樣本Meta分析顯示，IL-18（rs1946518、rs187238）是亞洲人群及非洲人群的CD易感位點，但與高加索人群CD易感性無關［10］。這些來自不同人群的研究結果表明，IL-18基因多態性對IBD的影響可能與種族遺傳差異密切相關。

本研究進一步組內分層分析發現，L-18（rs1946518）基因多態性與UC臨床病理特征相關。與廣泛結腸炎患者比較，遠端結腸炎患者中基因型（GC+CC）頻率升高，提示攜帶rs1946518（GC+CC）基因型UC患者更易發生遠端結腸炎。目前有關IL-18基因多態性影響UC疾病部位的分子機制尚不明確。有研究發現盡管單個核細胞分泌IL-18水平受其遺傳多態性影響，但外源性抗原激活單個核細胞是促發IL-18表達的重要條件。值得注意的是，IL-18基因多態性對IL-18表達的影響只在某些特定的激活劑如細菌脂多糖、抗CD3/CD28抗體誘導下呈現，而在其他激活劑如植物血凝素（PHA）誘導下，其基因多態性對IL-18表達無影響［7］，這表明IL-18基因的表達與環境因素密切相關。由于人類結腸不同腸段中腸道菌群及黏膜微環境存在差異，因此作者推測IL-18基因對UC疾病部位的影響可能是其遺傳多態性和腸道微環境差異等多方面因素綜合作用的結果。

綜 上 所 述，IL-18（rs1946518、rs187238） 基因2個SNP與浙江漢族人群CD的易感性無關，而rs1946518基因突變不僅可能增加UC的發病風險，還可能影響UC患者的疾病部位。需要指出的是，由于體內IL-18信號所介導的炎癥反應和免疫應答錯綜復雜，我們尚不能完全詮釋該信號途徑對UC發病機制的潛在影響，這有待于進一步研究探討。