雙拷貝tylD、tylF和tylJ弗氏鏈霉菌工程菌株構建及其發酵性能研究

馬次郎 陳奕公 劉曉明 王文超 朱慧 蘇建宇,*

(1 寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2 寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

泰樂星(tylosin,Tyl)是一類十六元大環內酯類獸用抗生素，其抗菌譜廣，在應對革蘭陽性菌感染以及畜牧增產方面發揮了巨大作用，被廣泛應用于獸藥及飼料添加劑。目前，在大規模工業生產中，弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradie)是泰樂菌素的主要生產菌[1-3]。

弗氏鏈霉菌泰樂菌素生物合成基因簇(tylgene cluster)從抗性基因tlrB延伸至tlrC，共有85kb，含43個ORFs提供泰樂菌素合成所需完整的結構基因[4]，分為tylIBA區域，tylLM區域，tylG區域，tylCK區域和tylEDHFJ等5個主要區域[5]。tylJ、tylD和tylF位于tylEDHFJ區域，其中tylJ和分別編碼TDP-脫氧己糖3-差向異構酶(TDP-deoxyhexose 3-epimerase)和TDP-脫氧己糖4-酮基還原酶(TDP-deoxyhexose 4-ketoreductase)，催化TDP-4-酮基，6-脫氧葡萄糖(TDP-4-keto,6-deoxyglucose)轉化為TDP-6-脫氧阿洛糖(TDP-6-deoxyallose)[6]。tylF編碼的大菌素-O-甲基轉移酶(macrocin-O-methyltransferase,MOMT)催化大菌素轉化為泰樂菌素，是泰樂菌素生物合成中的關鍵限速酶[7]。

泰樂菌素的合成受各種結構基因及多種相關酶調控，除主代謝通路以外，還存在著眾多的分支途徑[8]，在這個過程中會生成多種中間產物和副產物(包括很多未知成分)，構成錯綜復雜的代謝網絡[9]。弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的代謝過程中，O-碳霉氨基糖泰樂內酯(O-mycaminosyltylonolide,OMT)形成后有兩條代謝流，一條結合6-脫氧-D-阿洛糖糖基形成去甲基拉克亭霉素，另一條轉化為6-脫氧-D-阿洛糖泰樂菌素(demycinosyltylosin,DMT)，后者產生更多副產物，影響泰樂菌素的質量。為削弱DMT的合成通路，可選擇增加6-脫氧-D-阿洛糖合成路徑上的兩個關鍵基因tylJ和tylD的拷貝數，以此來強化OMT到去甲基拉克亭霉素的合成轉化。大菌素甲基化轉化為泰樂菌素是泰樂菌素合成代謝中的關鍵限速步驟，增加編碼大菌素-O-甲基轉移酶的tylF基因拷貝數可提升大菌素的轉化速率，在縮短發酵周期的同時提高泰樂菌素發酵水平[10]。綜合以上分析，采取倍增tylJ、tylD和tylF基因拷貝數的策略對弗氏鏈霉菌進行分子改造，能夠實現強化泰樂菌素主代謝流，減少發酵過程中副產物生成，提高目的產物產量和質量(純度)目的，獲得具有優良發酵性狀的泰樂菌素工程菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

弗氏鏈霉菌工業菌株；E.coliDH5α，本實驗室保存；E.coliET12567(pUZ8002)，中國科學院微生物研究所楊科遷教授惠贈；pSET152質粒，中國農業大學宋源教授惠贈；pTYL02質粒(pSET152衍生質粒，含PermE)，本實驗保存。

1.2 培養基和主要試劑

1.2.1 培養基

LB培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，pH7.0(用于大腸埃希菌培養)；高氏一號培養基(購自青海海博生物科技有限公司)：用于弗氏鏈霉菌固體培養；MS培養基(g/L)：甘露醇20，黃豆餅粉20，MgCl3·6H2O 4，瓊脂粉15，pH7.0(用于大腸埃希菌-弗氏鏈霉菌屬間結合轉移培養)；TSBY培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 5，pH7.0(用于弗氏鏈霉菌液體搖瓶發酵)。胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeast extract)購自Oxoid公司；D-甘露醇、瓊脂粉、溶菌酶購自Sarloio公司。

1.2.2 抗生素

硫酸安普霉素和萘啶酮酸：購自Sigma公司；泰樂菌素標準品(1026U/mg)：購自國家獸藥監察所。

1.2.3 工具酶

EcoRI、BamHI、EcoRV購自Fermentas公司。

1.3 目的基因的獲得

根據插入片段的堿基序列使用引物設計軟件Primer Premier 6分別設計PermE、tylF-tylJ、tylD的引物，其中在PermE的上下游引物兩端分別引入酶切位點EcoRI和BamHI，在tylF-tylJ的上下游引物兩端分別引入酶切位點BamHI和EcoRV，在引物tylD的上下游引物兩端引入酶切位點EcoRV，并在tylFtylJ、tylD的上游引物上分別添加了核糖體結合位點(ribosomal binding site,RBS)(表1)。分別以pTYL02質粒DNA和弗氏鏈霉菌基因組DNA為模板，PCR擴增獲得所需目的基因片段。

1.4 表達載體的構建

首先將PermE基因片段與載體pSET152連接，得到重組質粒pSET152-PermE，對其進行EcoRV與BamHI雙酶切，然后將tylF-tylJ基因片段與重組質粒pSET152-PermE連接，得到重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ，然后對其進行EcoR V單酶切。為防止發生載體自連，單酶切回收后的載體用去磷酸化酶進行處理，然后與tylD基因片段連接，構建重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD(圖1)。

圖1 pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD結構Fig.1 Structure of pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD

重組質粒導入感受態E.coliET12567中，涂布 LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)，37℃過夜培養，挑選單菌落接入新鮮LB培養液中，37℃過夜培養后，提取其質粒，使用表1中引物進行PCR驗證和酶切驗證。

1.5 表達載體的結合轉移及重組菌株的篩選

重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉化感受態E.coliET12567菌株，涂布LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)進行陽性轉化子篩選。篩選的陽性轉化子接入新鮮LB培養液中，37℃過夜培養后提取質粒，進行PCR驗證和酶切驗證。驗證后的重組E.coliET12567菌株與弗氏鏈霉菌的預萌發孢子液(受體菌)混合涂布在MS培養基平板上，通過大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉移，將pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉入弗氏鏈霉菌出發菌株內，得到弗氏鏈霉工程菌株FJD。

1.6 弗氏鏈霉菌工程菌株驗證

隨機選取30個工程菌株單菌落，分別接種至發酵培養基中，以出發菌株為對照，28℃、200r/min搖瓶發酵7d，測定發酵液泰樂菌素效價。

工程菌株FJD接入發酵培養基中，28℃、200r/min搖瓶發酵48h，取樣，以15%接種量接入新的培養基中傳代培養。連續傳代10代后，收集菌體，提取基因組DNA，卡那霉素和安普霉素抗性驗證工程菌株質粒穩定性。

1.7 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達分析

以rpoB作為內參基因，采用ΔΔCT值法[11]，對工程菌株tylD、tylF、tylJ基因相對于出發菌株對應基因的表達量進行qPCR分析。

1.8 泰樂菌素效價測定

1.8.1 標準曲線制備

稱取泰樂菌素標準品，用去離子水配制400、500、600和700μg/mL的泰樂菌素標準品溶液；分別吸取不同濃度的標準品溶液1mL于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L HCl定容，得到12、16、20、24和28μg/mL的泰樂菌素標準液，往復顛倒搖勻靜置；290nm下測定標準液吸光度A值(0.1mol/L HCl為參比)，以標準液濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪制泰樂菌素標準曲線(圖2)。

1.8.2 發酵液泰樂菌素效價測定

取50mL發酵液，加入2mL 20% Al2(SO4)3溶液進行絮凝，過濾；取過濾液，根據預估效價對濾液進行適當稀釋；吸取1mL稀釋液于25mL容量瓶內，加入0.1mol/L HCl定容，往復顛倒混勻；290nm下測A值(0.1mol/L HCl為參比)，根據標準曲線表結合稀釋倍數計算發酵液中泰樂菌素含量。

泰樂菌素效價(U/mL)=測試樣品泰樂菌素含量(μg/mL)×1.026，式中1.026為根據泰樂菌素標準品確定的效價/質量換算系數。

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建

重組質粒經PCR和酶切驗證，分別得到了與預期大小一致的tylF～tylJ片段(1434bp)和tylD(1026bp)片段，表明重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD構建成功(圖3)。

2.2 弗氏鏈霉菌FJD工程菌株泰樂菌素發酵效價

出發菌株與30株工程菌株泰樂菌素搖瓶發酵效價見表2。結果表明，隨機選取的30株工程菌中，20株泰樂菌素發酵效價高于出發菌株，其中最高的1株發酵效價較出發菌株提高了28.1%，具有良好的生產應用價值。

圖2 泰樂菌素標準曲線Fig.2 Standard curve of tylosin

圖3 重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pSET152-PermEtylF-tylJ-tylD

表2 30株工程菌與出發菌株搖瓶發酵效價Tab.2 Shaking flask fermentation potency of 20 engineering strains and initial strain

2.3 工程菌株的穩定性

pSET152質粒不含鏈霉菌復制起始位點。重組質粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD通過大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉移至弗氏鏈霉菌后，如沒有整合到染色體上，將不能在弗氏鏈霉菌中復制，從而在菌體生長過程中丟失，工程菌也因此喪失質粒所攜帶的卡那霉素和安普霉素抗性。 以搖瓶效價最高的1株工程菌株為供試菌株，發酵培養基中連續傳代10次后，工程菌在安普霉素抗性平板上生長良好，與對照的無抗生素平板上生長狀態沒有差異，表明重組質粒已經穩定的整合在弗氏鏈霉菌染色體上。

2.4 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達分析

將工程菌株目的基因CT值用對應的內參基因rpoB的CT值進行標準化處理，采用ΔΔCT法計算tylD、tylF和tylJ在弗氏鏈霉菌出發菌株中的相對表達，并以出發菌株中相應目的基因的表達水平為參照，計算工程菌中tylD、tylF和tylJ的相對表達情況，結果如圖4～6。

在168h的發酵周期中，工程菌tylD的表達較出發菌株均有提高，其中24h時工程菌tylD的表達水平為出發菌株的1.26倍，72h時達到出發菌株的2倍，并一直保持較高的表達水平。

圖4 工程菌株tylD基因相對于出發菌株的表達量Fig.4 Expression of tylD gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖5 工程菌株tylF基因相對于出發菌株的表達量Fig.5 Expression of tylF gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖6 工程菌株tylJ基因相對于出發菌株的表達量Fig.6 Expression of tylJ gene of engineering strain relative to that of initial strain

發酵24h時tylF表達量與出發菌株一致(相對表達量為1)，發酵48h時tylF相對表達量開始升高，至96h時達到最高水平，約為出發菌株的2.18倍，并在之后發酵過程中始終保持較高的表達量。

整個發酵過程中工程菌tylJ的表達量始終高于出發菌株，其中發酵前期工程菌tylJ基因表達量顯著高于出發菌株，72h時其表達量達到出發菌株的2.3倍，其后該基因的相對表達量逐漸下降，至發酵144h時，工程菌tylJ表達量保持在出發菌株表達量的1.4倍左右(表3)。

qPCR分析結果表明，轉入的tylD、tylF和tylJ基因在弗氏鏈霉菌中均得到有效的表達，工程菌中上述3個基因的表達水平均高于出發菌株。

3 討論

增加合成代謝途徑中關鍵酶基因的拷貝數是鏈霉菌代謝工程育種的有效手段[12]。范亮等[13]構建了具有雙拷貝tylF基因的泰樂菌素基因工程菌，其泰樂菌素搖瓶發酵效價較出發菌提高了32.7%。由于泰樂菌素合成代謝網絡的復雜性，增加tylF的拷貝數能降低發酵產物中中間代謝產物大菌素的含量，提高泰樂菌素的產量，但無法降低DMT等發酵副產物(雜質)的積累。本研究針對泰樂菌素生產中組分轉化及主要副產物產生情況，在對弗氏鏈霉菌泰樂菌素代謝調控網絡分析的基礎上，選擇碳霉糖合成路徑上的兩個關鍵基因tylD與tylJ以及泰樂菌素合成途徑中關鍵的限速酶基因tylF，構建具有雙拷貝tylD、tylJ和tylF的弗氏鏈霉菌工程菌株，以達到調整并強化泰樂菌素的主合成代謝通路，提高抗生素產量，減少DMT等發酵副產物的目的。

表3 發酵過程中工程菌株tylD、tylF和tylJ基因表達特性Tab.3 Expression characteristics of tylD,tylF and tylJ in engineering strains during fermentation

在工業生產鏈霉菌工程菌株的構建中，整合型質粒的運用以及最適啟動子和核糖體結合位點的調節對鏈霉菌合成目的產物有極大的促進作用[14-17]。本研究以弗氏鏈霉菌基因組DNA為模版，克隆得到目的基因tylD和tylF-tylJ；使用整合型表達載體pSET152和組成型強啟動子PermE，保證發酵過程中工程菌的穩定性，強化多拷貝的tylF、tylJ以及tylD的表達；tylF、tylJ采用自身RBS序列，tylD自身的RBS位于tylHII內，其序列經分析不符合最佳的RBS堿基排列，而tylHII的RBS序列滿足理想RBS堿基排列的條件，因此將tylHII的RBS序列與tylD的CDS序列銜接，調轉插入整合型質粒中。采用上述構建策略，最終得到一株弗氏鏈霉菌工程菌株，其發酵效價較出發菌株提高了28.1%，經熒光定量PCR檢測，該菌株發酵過程中tylF、tylJ、tylD表達量較出發菌株有明顯提高，可望作為優良生產菌種用于泰樂菌素的發酵生產。