新型孔徑陶瓷膜澄清棒酸發酵液的研究

朱傳柳 趙士明 章小同 李新慧 彭文博

(江蘇久吾高科技股份有限公司，南京 210061)

棒酸(clavulanic acid)，又稱克拉維酸，是由棒酸鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)產生的一種β-內酰胺酶抑制劑[1-2]。棒酸具有抗菌能力弱、抑酶能力強的特點，因為其本身僅有微弱的抗菌活性，但對各種β-內酰胺酶有強抑制作用，可與β-內酰胺酶牢固結合，生成不可逆的結合物，具有強力而廣譜的抑制β-內酰胺酶的作用[3-4]。此外，棒酸與β-內酰胺類抗生素合用起協同作用，單獨應用無效，常與青霉素類藥物合用治療葡萄球菌屬或革蘭陰性菌所致的疾病[5-6]。

傳統棒酸發酵液的澄清方法主要采用板框壓濾和萃取，該提純方法的缺點是板框過濾的自動化程度低，人工成本高，且板框處理后的濾液仍含有較多可溶性蛋白；萃取過程中易發生乳化現象，且萃取需要消耗大量溶媒，設備投資高、運行成本高，收率較低[7-9]。隨著膜技術的發展，膜分離技術以其特有的優勢將不同粒徑大小的物質進行分離，已經在發酵液提取分離領域有著廣泛的應用[10-11]。如今棒酸的生產工藝(圖1)就主要采用膜集成工藝進行澄清，即“50nm陶瓷膜和有機膜(1～3萬分子量)”過濾澄清。該方法不僅大大減少了溶劑的使用，降低了廢水處理的投資，還提高了產品的收率和品質[8,12]。但該澄清方法中有機膜的使用壽命較短(正常情況下只能使用1年)，投資成本較高，不適合大規模的應用。

近年來，隨著膜技術的快速發展，更小孔徑的新型陶瓷膜研發成功，如1、2、4、5、8、10和20nm等，且在氨基酸、蔗糖、抗生素等已大規模應用[13-15]?；诖耍疚臄M采用新型孔徑陶瓷膜對棒酸發酵液進行一步陶瓷膜法澄清研究，取代“50nm陶瓷膜和有機膜(1～3萬分子量)”過濾澄清方法，從而簡化棒酸生產工藝流程、降低生產成本和運行成本，從而提高產品的競爭力和行業的技術水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棒酸發酵液：山東某棒酸生產公司提供；磷酸氫二鈉(色譜純)、甲醇(色譜純)等：國藥集團化學試劑有限公司；棒酸標準品：美國Sigma公司。

圖1 目前棒酸的生產工藝Fig.1 Current production process of clavulanic acid

1.2 設備與儀器

陶瓷膜設備(膜元件：孔徑分別為4、5、8、10、50nm 19通道的膜管，膜管長度1016mm；膜組件：單支膜組件，面積0.2～0.3m2)：由江蘇久吾高科技股份有限公司自制；Agilent 1100液相色譜儀：美國Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

(1)膜集成工藝法澄清：取發酵好的棒酸發酵液100L，調pH至5.0～5.5，將其送入50nm陶瓷膜進行過濾，過濾的溫度控制在10～14℃，過濾壓力為0.25Mpa，濃縮至1.6倍后，開始加入軟化水洗濾，加水量為原液體積的2.5～3.0BV，得到陶瓷膜滲透液。

然后將得到的陶瓷膜滲透液送入有機超濾膜過濾裝置進一步除雜，有機膜截留分子量為10000Da，過濾的溫度控制在10～14℃，過濾壓力為0.4Mpa，循環流量為1.5m3/h。最后獲得有機膜滲透液。并用相關檢測方法分別檢測發酵液、陶瓷膜滲透液和有機膜滲透液中的棒酸含量以及蛋白含量等。

(2)一步陶瓷膜法澄清：取發酵好的棒酸發酵液100L，調pH至5.0～5.5，將其分別送入孔徑為4、5、8和10nm陶瓷膜進行過濾，過濾的溫度控制在10～14℃，過濾壓力為0.4Mpa，濃縮至1.6倍后，開始加入軟化水洗濾，加水量為原液體積的2.5～3.0BV，得到陶瓷膜滲透液。并用相關檢測方法分別檢測發酵液、陶瓷膜滲透液中的棒酸含量以及蛋白含量等。

(3)陶瓷膜操作參數的優化：①操作壓力的優化：取50kg棒酸發酵液置于陶瓷膜設備中，設定操作壓力分別為3.5、4.0和4.5bar，膜面流速4m/s，溫度10～14℃，陶瓷膜濃縮1.6倍，加2.5BV純水連續洗濾菌液，考察操作壓力對陶瓷膜過濾通量的影響。

②膜面流速的優化：取50kg棒酸發酵液置于陶瓷膜設備中，設定膜面流速分別在3、4和5m/s，控制操作壓力0.4MPa，溫度10～14℃，陶瓷膜濃縮1.6倍，加2.5BV純水連續洗濾菌液，考察膜面流速對陶瓷膜過濾通量的影響。

③濃縮倍數與洗水倍數的優化：取50kg棒酸發酵液置于陶瓷膜設備中，首先控制濃縮倍數分別為1.5、1.6、1.65和1.7倍，再分別加原液的2.5BV純水洗濾菌液，考察陶瓷膜濃縮倍數對陶瓷膜過濾通量和收率的影響；其次控制濃縮倍數為1.65倍，再加原液的2.5、2.7和3.0BV的純水洗濾，考察洗水倍數對陶瓷膜過濾通量和收率的影響。

1.3.2 分析方法

(1)棒酸效價的測定：采用高效液相色譜法測定，詳細步驟如文獻[8]所示。

(2)蛋白含量測定：采用凱氏定氮法測定，詳細步驟如文獻[16]所示。

(3)棒酸截留率的測定：在膜分離過程中，待陶瓷膜設備穩定運行10min以后，取某一時刻的瞬時清液和濃液，再測定瞬時清液和濃液中的棒酸含量，按下述公式計算棒酸的截留率：

式中，c為棒酸的截留率(%)；w2為陶瓷膜透過液中棒酸的質量分數(%)；w1為濃縮液中棒酸的質量分數(%)。

(4)陶瓷膜通量的測定[14,17-18]：設備穩定運行后，測定陶瓷膜過濾過程中某一時間點的通量情況，即計算出單位時間、單位膜面積滲透液出來的體積，計算方法如下：J=V/(S×t)。

式中，J為通量，單位：L/(m2·h)；V為t時間內滲透水的體積，單位：L；S為膜面積，單位：m2；t為測量的時間，單位：h。

2 結果與討論

2.1 新型孔徑陶瓷膜的澄清效果

根據棒酸的性質，以及分子量等，選擇4、5、8和10nm 4支新型孔徑陶瓷膜進行過濾分離，分別比較膜過濾通量、除雜效果，以及收率，確定較優孔徑的陶瓷膜。

2.1.1 膜過濾通量的比較

由于陶瓷膜孔徑的差異，其膜過濾通量和滲透液質量也存在一定的差異。因而在相同條件下(溫度10～14℃，P=3.5bar，膜面流速=4m/s)，處理同一批次棒酸發酵液，4種不同新型孔徑的陶瓷膜(4、5、8和10nm)的過濾通量如圖2所示。

由圖2可知，4和5nm陶瓷膜過濾通量較低；10nm陶瓷膜起始通量優于8nm陶瓷膜，但是后期通量衰減較快，下降較明顯。這可能是由于后期發酵液濃度較高，膜表面濃差極化更加嚴重，發酵液中的雜質分子粒徑與10nm陶瓷膜孔徑大小較接近，更容易堵膜，導致10nm陶瓷膜通量降低較快。8nm陶瓷膜的過濾通量最優，平均通量可達57kg/(m2·h)。綜上，就過濾通量而言，8nm陶瓷膜更加適合棒酸發酵液的澄清。

圖2 不同孔徑陶瓷膜的通量隨時間的變化曲線Fig.2 Flux of different pore size ceramic membranes over time

2.1.2 除雜效果和收率的比較

由于陶瓷膜孔徑大小的不同，因而對棒酸發酵液的除雜效果、棒酸的截留率也不相同。4種不同新型孔徑的陶瓷膜過濾后清液的效果由表1所示。

從表中可以看出，4和5nm陶瓷膜過濾后的清液雜質較少、質量較好，但是這兩種陶瓷膜對棒酸的截留率較高，分別有24.6%和20.1%，會導致收率很低，因而不適合進行棒酸發酵液的過濾。8和10nm陶瓷膜對棒酸也有截留，但是截留率很低，當后期向發酵液中加入原體積3.0BV的純水洗濾時，該部分被截留的棒酸也會慢慢被洗出來。而且8nm陶瓷膜過濾后的清液質量明顯優于10nm陶瓷膜。因此，相對來說，8nm陶瓷膜的除雜效果和收率更佳。

2.2 陶瓷膜工藝優化

由“2.1”項可知，8nm陶瓷膜更適合棒酸發酵液的除雜澄清，因而本節進一步通過調控操作參數(操作壓力、膜面流速、濃縮倍數等)，優化陶瓷膜過濾，提高膜過濾通量和棒酸收率。

2.2.1 操作壓力的優化

膜過濾過程是以壓力為驅動力的分離過程，一般情況下，隨著壓力的提高，滲透液出來的速度也會加快；但同時濃差極化現象也會更加嚴重，易導致膜層被堵，使膜過濾通量降低。因此，合適的操作壓力對膜過濾通量有著至關重要的作用[18]。8nm陶瓷膜在不同操作壓力下的過濾通量由圖3所示。

表1 不同孔徑陶瓷膜過濾清液的對比Tab.1 Comparison of different aperture ceramic membranes filtrate

由圖3可知，不同跨膜壓力差下，8nm陶瓷膜過濾的通量變化趨勢相對一致，都是先逐漸下降，然后保持一個相對穩定的通量過濾。3種操作壓力(3.5、4.0和4.5bar)下，各自平均過濾通量分別為52、60和61kg/(m2·h)。4.0和4.5bar的操作壓力下，膜平均過濾通量相近；但壓力越高，能耗越大。因此，選擇操作壓力為4.0bar時過濾棒酸發酵液更為合適。

圖3 不同操作壓力對陶瓷膜的通量的影響Fig.3 Effect of different operating pressures on the flux of ceramic membrane

2.2.2 膜面流速的優化

其他操作參數不變，控制膜面流速分別為3、4和5m/s時，考察陶瓷膜滲透液通量變化，結果如圖4所示。

圖4 不同膜面流速對陶瓷膜過濾通量的影響Fig.4 Effect of different membrane flow velocity on filtration flux of ceramic membrane

當把膜面流速從3m/s提到4m/s時，通量有所上升；但繼續提高至5m/s時，通量變化不大。因此，一開始膜面流速提高有利于增大料液與膜之間的剪切力，從而減緩膜污染的速度；但膜面流速較大時，不僅耗能大，且易產生泡沫而影響體系的穩定性[18]。因而，膜面流速為4m/s時，過濾棒酸發酵液較合適。

2.2.3 濃縮倍數和洗水倍數的優化

一般情況下，處理相同體積的料液，濃縮倍數越高，過濾后剩余的濃液就越少；需要加水洗濾時，所需的清洗加水量就越小，過濾時間就越短。但是另一方面，隨著料液逐漸濃縮，總固形物將增大，料液通量會逐漸下降，過濾時間將大大延長[19]。因此，需要找到最佳濃縮點，來保證過濾時間較短，收率較高。因而將棒酸發酵液使用8nm陶瓷膜過濾，溫度控制在10～14℃，膜面流速4m/s，濃縮至一定倍數后開始加水連續洗濾，以每次2L的洗水量控制洗水的進出速度，實驗結果如表2所示。

表2 濃縮倍數、洗水倍數與收率的關系Tab.2 The relationship between the yield and the multiple of concentration and the multiple of washing water

由表2可知，隨著濃縮倍數的提高，當加入等體積的水洗濾時，收率逐漸提高，但膜過濾平均通量逐漸降低；綜合考慮收率和過濾時間，將濃縮倍數定在1.65倍時，開始加水洗濾較為合適。此外，當濃縮倍數一定時，隨著加水量的增大，收率也逐漸上升；綜合考慮收率和成本，加水洗濾3.0BV時效果較佳，收率可達97.5%。

綜上，通過研究發現，棒酸發酵液在溫度10～14℃、濃縮1.65倍、加水洗濾3.0BV效果較佳，膜過濾通量可達62L/(m2·h)，比優化前提高了10.7%；收率為97.5%，提高了2.5個百分點。

2.3 一步膜法工藝與膜集成工藝的對比

目前，大多數棒酸生產廠家均采用膜集成工藝澄清棒酸發酵液。因而將一步膜法澄清的新工藝與膜集成工藝就清液質量、棒酸收率和成本進行比較，其結果如表3所示。

由表3可知，8nm陶瓷膜處理后的清液與膜集成工藝處理后的清液質量相比，膜集成技術法稍優，但不明顯；當后期添加原液的3.0BV純水洗濾時，兩種技術處理后最終得到的混合清液的效果基本一致。表中的澄清成本是指處理一噸的棒酸發酵液兩種澄清方式所需要大概的人工費、設備費、水電費等總費用。由表3可知，膜集成工藝的澄清成本明顯高于一步8nm陶瓷膜澄清法。此外，一步8nm陶瓷膜法澄清相比于膜集成工藝，其運行成本(人工費+水電費+設備折舊維修等)降低了約2倍，投資成本降低了約1.6倍(減少了一套有機膜設備)，收率還提高了約2.5%。而且8nm陶瓷膜一步處理法已經完成中試，并成功得到合格的產品。因而，一步陶瓷膜法可替代目前的膜集成工藝法澄清技術，不僅簡化了棒酸生產工藝流程，還提高了收率，降低了投資成本和運行成本。

表3 一步膜法工藝與膜集成工藝的比較Tab.3 Comparison of one-step membrane process and membrane integration process

2.4 陶瓷膜的清洗

棒酸發酵液中含有較多的培養基原料、菌絲體以及蛋白質等，在進行陶瓷膜過濾時，與膜孔徑大小相近的雜質會進入膜孔內部，造成膜孔堵塞，影響膜的過濾性能[14,18,20]。因此，每批次陶瓷膜過濾實驗完成后，都要停機進行膜的清洗、再生以恢復膜元件的過濾性能。

針對棒酸發酵液體系，通過多次實驗考察，清洗方法如下：首先可用水沖刷，去除管道和膜表面的可逆污染；再配置質量分數為1%～2%的NaOH、0.5%～1.0%NaClO在60℃以上清洗1h，去除難分解的污染物；再用水沖洗至中性，如此水通量每次恢復率可達98%以上。

3 結論

3.1 新型孔徑陶瓷膜的選擇以及陶瓷膜工藝的優化

通過比較，8nm陶瓷膜較優；在溫度10～14℃、濃縮1.65倍、加水洗濾3.0BV效果較佳，膜過濾通量可達62L/(m2·h)，比優化前提高了10.7%；收率為97.5%，提高了2.5%。

3.2 一步新型孔徑陶瓷膜法與膜集成工藝法澄清效果的對比

一步8nm陶瓷膜法澄清效果與之相近，但運行成本降低了2倍，投資成本降低了1.6倍，收率還提高了約2.5%。

3.3 陶瓷膜的再生

采用常規的清洗方法，陶瓷膜的水通量即可恢復，再生性較好。