激光粒度儀測定環索奈德粒度分布的應用研究

沈丹丹 曾令高 許娟 肖波,*

(1 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；2 重慶市化學藥品質量控制與評價產業技術協同創新中心，重慶 401121；3 重慶仁澤醫藥科技有限公司，重慶 400021)

環索奈德是由Altana Pharma AG(已被武田制藥公司收購)開發的一種適用于支氣管哮喘和過敏性鼻炎的皮質類固醇。該藥物是前體藥物，能水解成活性代謝產物去異丁酰基環索奈德。環索奈德首先是作為治療成人哮喘的藥物，以商品名Alvesco?，于2005年1月在英國上市，現已在包括美國、歐盟和日本各國在內的26個國家上市。此后，作為治療過敏性鼻炎的藥物，以水性鼻噴霧劑的劑型，由Nycomed公司在加拿大、阿根廷、巴西、墨西哥、香港、韓國、馬來西亞上市；由Sunovion公司在美國上市，商品名Omnaris。用于治療成人和12歲以上兒童季節性和常年性過敏性鼻炎所引起的鼻部癥狀。2008年1月，美國食品藥品監督管理局(FDA)追加批準本品用于6歲以上兒童季節性過敏性鼻炎的治療[1]。

本品的混懸型鼻噴霧劑型，微粉化環索奈德混懸于處方中。對于混懸產品，藥物粒徑對于溶出速率及在鼻內起效部位的利用率可能是重要的，應控制活性成分的粒度分布。按照中國藥典(ChP)2015四部通則0982粒度和粒度分布測定法[2]和FDA《鼻腔噴霧劑，吸入溶液、混懸液，及噴霧藥品——化學、制造及控制文件》的要求[3]，本文研究建立了微粉化環索奈德的粒徑分布測定法，按照相關指導原則進行了方法學驗證，并與顯微鏡技術進行比較，進一步確定本方法的準確性。

1 試驗材料

1.1 試驗儀器

激光粒度儀器系統(主機：Mastersizer 2000-激光粒度儀、樣品處理單元：Hydro MU、軟件版本：Mastersizer 2000版5.12C，英國Malvern公司)；Morphologi G3顆粒粒度及粒形圖像分析儀(英國Malvern公司)。

1.2 藥品與試劑

吐溫20(中國食品藥品檢定研究院，批號：101075-201602，含量：99.7%)；六偏磷酸鈉(南京化學試劑股份有限公司，批號：20161104，含量：99.0%)；焦磷酸鈉(南京化學試劑股份有限公司，批號：20161104，含量：99.0%)；環索奈德(自制，批號：20180122，含量：99.9%)；微粉化環索奈德(自制，批號：20180212、20180301、20180302、20180303)；去離子水(自制)。

2 方法與結果

2.1 測定參數

樣品處理單元設置：泵轉速：2000r/min；超聲能量：12.5；超聲定時：120s。

儀器檢測參數設置：光學特性：樣品物質名稱：默認(Default)；分散劑名稱：水(water)。

結果計算：模型：通用；計算敏感度：常規；顆粒形狀：不規則；測量次數：2；樣品測量時間：10s；樣品測量快照：10000；背景測量時間：10s；背景測量快照：10000。

遮光度界限：下限10%；上限15%，重復測量：測量循環數：2；測量之間延遲：5s。

平均結果：從測量創建平均結果記錄，分散劑：500mL經0.22μm濾膜過濾的去離子水或注射用水，表面活性劑及濃度：吐溫20(0.01%，W/W)。

2.2 測定方法

2.2.1 供試品混懸液的配制

取吐溫20，加入經0.22μm濾膜過濾的去離子水或注射用水(分散劑)，配制成0.01%W/W的水溶液。取適量(0.05g)微粉化的環索奈德，加入吐溫20溶液(20mL)，用平勺混合均勻。

2.2.2 測定法

按照Mastersizer 2000-激光粒度儀操作規程操作。向分散池中加入500mL經0.22μm濾膜過濾并超聲脫氣的去離子水，選擇手動測定模式。按照“2.1”項下設定儀器參數，背景測量后，緩緩加入供試品，至遮光度狀態條進入綠色部分后，進行測量。

2.3 檢測條件的選擇

依次選擇分散劑、表面活性劑、超聲條件，決策樹流程圖見圖1[4]。

2.3.1 分散劑的選擇

根據國外上市產品說明書中公布的理化性質，環索奈德溶解于N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇(純度99.5%)，極微溶解于正己烷、不溶解于水[5]。因此首選去離子水作為分散劑。取微粉化環索奈德原料藥適量，加入去離子水，充分攪拌，可見環索奈德粉末無法完全分散在去離子水中，小部分混懸在去離子水中并有團聚現象，大部分則呈漂浮狀態，因此需使用表面活性劑。

2.3.2 表面活性劑或穩定劑的選擇

環索奈德在1-辛醇與pH7.4磷酸鹽緩沖液之間的分配系數(logP)為5.1，屬弱極性化合物。按照ISO 14887:2000的要求[6]，選擇六偏磷酸鈉(穩定劑)、焦磷酸鈉(穩定劑)和吐溫20(表面活性劑)進行篩選。取微粉化環索奈德0.05g，置于50mL燒杯中，加入不同濃度的表面活性劑或穩定劑水溶液20mL，充分攪拌后超聲2min，觀察是否有團塊沉積在燒杯底部或絮凝現象，結果見表1。

結果表明：極低濃度(＞0.001g/L)的吐溫20表面活性劑就足以改善顆粒的潤濕，能有效穩定分散微粉化的環索奈德。使用高濃度可能會在分散裝置內產生氣泡，可能造成樣品中有大顆粒的不實測定結果，因此在供試品配制時加入0.01%W/W的吐溫20。

2.4 專屬性試驗

表1 表面活性劑或穩定劑浸潤微粉化環索奈德的結果Tab.1 Results of infiltration of micronized ciclesonide with surfactants or stabilizers

取吐溫20，加入注射用水(分散劑)，配制成0.01%W/W的水溶液。取4mL吐溫20溶液，加入至500mL注射用水中，依法檢測。結果表明：空白樣品遮光度為0，說明分散劑、表面活性劑在該測定條件下不影響微粉化環索奈德的粒度測定。

2.5 測定過程中的分散穩定性

整個測定過程中包含3個階段：(1)攪拌和泵分散階段；(2)超聲分散階段；(3)超聲后測定階段。為了考察測定過程中的樣品是否充分分散并達到穩定分散階段，設定等時間距的測量循環數和測量之間延遲，分別在上述3個階段實時跟蹤粒徑變化；同時考察樣品是否在測定過程中發生溶解行為。以泵轉速：2000r/min；超聲能量：12.5；超聲定時：140s；測量循環：20，其余參數同“2.1”項。

根據粒度的實時監測結果(表2)：(1)攪拌和泵分散階段：此時遮光度基本無變化，未見遮光度迅速下降，表明被測物質未溶解于所選分散劑中，從而印證分散劑和表面活性劑選擇是合理的。(2)超聲分散階段(圖2～3)：隨著超聲時間的增加，粒徑趨于穩定的平臺期，這表示為完全分散狀態。未見粒徑隨時間的推移不斷減小，這表明在超聲過程中未發生顆粒碎裂。(3)超聲后測定階段：粒徑和遮光度均保持穩定，表明此分散條件是優選的。

表2 粒度的實時監測結果Tab.2 Real-time monitoring results of particle size

圖2 分散過程中粒徑變化的曲線Fig.2 Curve of particle size change during dispersion

圖3 分散過程中遮光度變化的曲線Fig.3 Curve of laser obscuration change during dispersion

2.6 耐用性試驗

為了考察測定條件發生小的變動時，粒度測定結果受到影響的程度，考察了以下幾個典型變動因素：泵轉速、遮光度、超聲時間、超聲強度及樣品測量時間。

2.6.1 泵轉速的影響

通過粒徑測定值如何隨泵轉速增加而變化來優化泵/攪拌器速度。設定泵轉速：300、500、700、1000、1500、2000、2500和3000r/min，其余參數同“2.1”項下，考察粒徑隨著泵轉速增加的變化情況。以泵速為橫坐標、粒徑為縱坐標作圖如下(圖4)。

結果表明：在低速時，粒徑測定值較大；在較高泵速(1000～3000r/min)，粒徑測定值達到平臺值，粒徑保持不變。在這時，顆粒被正確置于測定池中。泵速應設置在此范圍內的中央(應約為2000r/min)。但不應默認為使用最快泵速，因為這可能導致產生氣泡。因此確定泵轉速為2000r/min。

2.6.2 遮光度的影響

必須確定樣品濃度，以便獲得可重現的散射數據，而不出現多重散射。對于細顆粒測量(尺寸＜10μm)，要求在不超過10%遮光率下測定。對于較粗的物質測量，可使用高達20%的遮光度，以便增大信號噪聲比。可通過穩定分散體的粒徑測定結果與遮光度的對應關系來判斷出現多重散射的濃度。本研究遮光度分別為：3.42%、5.01%、8.25%、9.80%、12.63%、15.14%和21.52%，其余參數同“2.1”項，考察粒徑隨著遮光度增加的變化情況(圖5)。

圖4 泵轉速對粒度測定結果的影響Fig.4 Influence of pump speed on particle size measurement

圖5 遮光度對粒度測定結果的影響Fig.5 Influence of laser obscuration on particle size measurement

結果表明：在過低遮光度(≤5%)時，粒徑的測定值很大，這可能是因為背景噪聲的影響；在適當的遮光度(10%～15%)時粒徑的測定值是保持不變的；在較高遮光度(＞15%)時，粒徑測定值略有變小，可能因為發生多重散射。因此確定遮光度范圍為10%～15%。

2.6.3 超聲時間的影響

通過粒徑測定值如何隨超聲時間增加而變化來優化超聲條件。設定超聲時間：0、30、60、90、120、150、180、210和240s，其余參數同“2.1”項，考察粒徑隨著超聲時間增加的變化情況(圖6)。

結果表明：當超聲時間達到90s以上，粒度測定結果基本保持不變，但是應避免過長時間的超聲，以免可能造成顆粒碎裂。因此確定超聲時間為120s。

2.6.4 超聲強度的影響

通過粒徑測定值如何隨超聲強度增加而變化來優化超聲條件。設定超聲強度：5.00、7.50、10.00、12.50和15.00，其余參數同“2.1”項，考察粒徑隨著超聲強度增加的變化情況(圖7)。

根據超聲強度的篩選結果：當超聲強度達到7.5以上，粒度測定結果基本保持不變，但是應避免強烈的超聲，以免可能造成顆粒碎裂。因此確定在超聲強度為12.5。

2.6.5 樣品測定的影響

通過粒徑測定值如何隨樣品測定時間增加而變化來優化樣品測定時間。設定樣品測量時間：5、10、15、20和30s，樣品測量快照：5000、10000、15000、20000和30000，背景測量時間：5、10、15、20和30s，背景測量快照：5000、10000、15000、20000和30000，其余參數同“2.1”項下，考察粒徑隨著樣品測定時間增加的變化情況(圖8)。

圖6 超聲時間對粒度測定結果的影響Fig.6 Influence of ultrasonic time on particle size measurement

圖7 超聲強度對粒度測定結果的影響Fig.7 Influence of ultrasonic energy on particle size measurement

圖8 樣品測定時間對粒度測定結果的影響Fig.8 Influence of sample measurement time on particle size measurement

根據超聲強度的篩選結果表明：樣品測定時間和背景測量時間在5～30s范圍內，粒度測定結果基本保持不變。

2.7 精密度試驗

按照“2.2.1”配制供試品混懸液，按照“2.1”項下設定參數，連續測定同一樣品6次(測量循環數：6)，記錄粒度檢測結果。結果表明連續測定6次，d0.1、d0.5及d0.9的相對標準偏差均小于1.0%，系統精密度良好(圖9)。

2.8 重復性試驗

根據USP34＜429＞[7]對于平行測定的要求：粒度分布的中心值(Dv50)的變異系數應小于10%；遠離中心值(Dv10和Dv90)的變異系數不得超過15%，數值小于10μm時，則變異系數的最大允許值可放寬一倍。取同一批樣品，按照“2.2.1”項下配制3份供試品，按照“2.1”項下設定參數，粒度測定結果如下(圖10和表3)，同一批次微粉化環索奈德3次代表性取樣的Dv10、Dv50及Dv90的變異系數均符合美國藥典的規定。

2.9 與參比技術(顯微鏡法)測定結果的比較

儀器型號：Morphologi G3顆粒粒度及粒形圖像分析儀，檢測法：按照“2.2.1”項下配制供試品。將樣品置于載玻片上，上面放蓋玻片。在Morphologi G3上按照標準操作程序進行測量[8]。

對比3個批次微粉化環索奈德的顯微鏡微觀粒度測定結果與激光衍射法測定粒度(表4和圖11)，二者基本吻合，說明開發的激光衍射法適用于微粉化活性成份的粒度測定，可作為中間體控制檢測方法。

3 討論

使用濕法分散進行粒度測定是迄今為止用于獲得可重現的激光衍射結果最廣泛的方法。濕法分析為跨越寬廣粒徑范圍的樣品提供了分散方法，涵蓋從亞微米顏料到砂粒和沉積物。對于大顆粒或多分散性分布體，濕分散劑的黏度能確保測定無偏差，因為很容易克服顆粒沉降的影響。由于各種濕分散劑可用于激光衍射測定，很容易實現不同顆粒體系的分散。還可通過某些方法優化分散穩定性，而干法測定則不能。這是由于當顆粒被分散劑潤濕后，可獲得比干粉分散體系更大的分散能量。因此，濕法分析往往是用于可重現性分散亞微米材料的唯一方法且是粗大材料的優選方法，尤其是牢固緊密聚集的粉末。在濕法分析中，顆粒的脆性也不是太大問題，因為與干法分析相比，這種分散方法的破壞性更小。

圖9 精密度試驗測定結果疊加圖Fig.9 Results of precision test

圖10 重復性試驗測定結果疊加圖Fig.10 Results of repeatability test

表3 重復性試驗檢測結果Tab.3 Results of repeatability test

表4 激光衍射法與顯微鏡法測定的粒度結果比較Tab.4 Comparison of particle size results measured by laser diffraction and image analysis

圖11 顯微鏡法粒度測定結果Fig.11 Results of particle size measured by microscopy method

當進行濕法激光衍射測定時，下一步是選擇一種適當的分散劑。重要的是，所選擇的分散劑對于激光束是透明的，能確保可進行光散射測量；有不同于待測顆粒的折射率，因為所觀測到的散射強度取決于折射率的差別；在測定過程中不溶解被測物質；能潤濕被測顆粒，能確保聚集物分散；能穩定分散后的顆粒，例如不發生再聚集；不是太黏稠，否則在測定過程中會形成氣泡。

在濕法測定過程中，分散的第一步是用所選的分散劑潤濕顆粒表面。在某些情況下，可能有必要使用表面活性劑引起潤濕。表面活性劑的作用是降低分散劑的表面張力。從而減小分散劑與顆粒表面的接觸角，有助于分散。表面活性劑的選擇取決于顆粒表面化學和分散劑的性質。

在SOP開發過程中，重要的是要考慮樣品量和分散裝置設置對于粒徑測定的影響。必須確定用于濕法激光衍射測量的樣品濃度，以便獲得可重現的散射數據，而不出現多重散射。

激光衍射法是通過測量激光束穿過被分散的顆粒樣品時散射光角度的不同對粒度分布進行測定。是使用米氏光散射理論，對角度散射光強數據進行分析，計算形成散射圖樣的顆粒粒度。因此受諸多因素影響，例如：折射率、分散劑種類及用量、分散效果等等因素影響。因此，常用圖像分析方法與激光衍射法進行比較，確定后者是否能夠反映樣品的真實粒度分布情況。

本研究建立了微粉化環索奈德激光粒度測定方法，該方法簡單、快速、準確、耐用性好，可用于微粉化環索奈德中間體控制的質量評價，為環索奈德微粉化工藝參數摸索提供評價手段，同時為本品制劑的產品開發提供研究基礎，從而達到質量可控的目的。