APRI、GPR和FIB-4預測抗病毒誘導的乙型肝炎肝硬化肝臟病理學回歸的性能評價

陸偉 劉丹萍 張占卿 王雁冰 丁榮蓉 周新蘭 黃丹 李秀芬 楊可芷

近10余年來，肝纖維化的無創預測取得了許多進展[1-3]。其中，肝臟彈性成像技術如瞬時彈性超聲(transient elastography, TE)、聲輻射力脈沖成像(acoustic radiation force impulse imaging, ARFI)和超聲剪切波成像(supersonic shear imaging, SSI)，以及無創數學模型如天冬氨酸轉氨酶/血小板比值指數(aspartate aminotransferase to platelet ratio index, APRI)和基于四因子的纖維化指數(fibrosis index based on the four factors, FIB-4)等，已經被推廣應用[4-6]。最近，Lemoine等[11]開發了一個新的比例模型，γ-谷氨酰轉肽酶/血小板比值(gamma-glutamyl transpeptidase to platelet ratio, GPR)，也能有效預測慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)肝纖維化水平[8-10]。

但是，迄今為止，關于肝纖維化無創預測的研究，絕大多數聚焦在對肝纖維化進展的預測[1-3, 7-10]，極少數涉及到對肝纖維化回歸的預測[11-17]。因此，目前尚不清楚對肝纖維化進展有預測價值的無創指標是否對肝纖維化回歸也有預測效應。本研究的目的，初步探討APRI、GPR和FIB-4及其構件預測長期抗病毒治療期間乙型肝炎肝硬化纖維化回歸和與其相關的肝臟壞死炎癥回歸的性能。

資料與方法

一、 研究對象

2009年1月—2015年12月在上海市公共衛生臨床中心住院的首次肝臟病理學評估(隨訪起點)為肝硬化的75例HBeAg陽性CHB患者入選本研究；入選患者在接受長期抗病毒治療12～57月(中位值30月，四分位距19～36月)后，于2017年6月前接受了再次肝臟病理學評估(隨訪終點)。75例患者中，2例、3例、18例和3例分別接受了拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋和阿德福韋酯的單一抗病毒治療；14例、33例、2例分別接受了拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋聯合阿德福韋酯的優化抗病毒治療。所有患者在抗病毒治療3個月內接受每月1次隨訪；如3月后血清HBV DNA仍超過檢測下限(<500 IU/mL)，采用聯合抗病毒方案并繼續接受每月1次隨訪；血清HBV DNA連續兩次低于檢測下限后，接受每3～6月1次隨訪。從隨訪起點后6月到隨訪終點的每次隨訪，所有患者血清HBV DNA均保持不可檢測。

隨訪起點前6月內曾接受干擾素類和核苷(酸)類抗病毒治療的患者被排除；隨訪起點或隨訪終點有遺傳性肝病、脂肪性肝病、慢性胃腸道疾病的患者被排除；從隨訪起點到隨訪終點，所有患者均無其他病毒性肝炎、藥物性肝損害、顯著飲酒(>20 g/d)以及接受干擾素類、甘草酸類、苦參堿/苦參素和傳統中醫治療的記錄。本研究得到了上海市公共衛生臨床中心倫理委員會的批準；所有患者在隨訪起點和隨訪終點接受肝活檢前均常規簽署知情同意書，研究過程遵循2013版Helsinki宣言。

二、病理學評估

肝臟活檢采用1秒鐘經皮肝穿刺法。標本采集后立即置塑料標本管內冰凍送檢。活檢標本的質量評價和肝臟病理學評估由1名有經驗的病理學醫師獨立完成。肝臟病理學評估采用Scheuer評分系統[18]。本研究將隨訪起點肝臟病理學分期=S4定義為肝硬化；隨訪終點肝臟病理學分級≤G2和分期≤S3分別定義為顯著壞死炎癥回歸(significant necro-inflammation regression, SINIR)和顯著纖維化回歸(significant fibrosis regression, SIFR)，病理學分級≤G1和分期≤S1分別定義為廣泛壞死炎癥回歸(extensive necro-inflammation regression, EXNIR)和廣泛纖維化回歸(extensive fibrosis regression, EXFR)。

三、實驗室檢查

血清HBsAg和HBeAg采用Abbott Architect I 2 000全自動化學發光免疫系統及其配套試劑檢測；其中，HBsAg線性檢測范圍為(0.05～250)IU/mL，如超過檢測上限，血清稀釋500倍重新檢測，HBeAg檢測下限為1.0 S/CO。血清HBV DNA采用Bio-Rad Icycler PCR系統檢測，試劑購自深圳Qiagen生物工程有限公司；線性檢測范圍為(500～5×107)IU/mL。

血清丙氨酸轉氨酶(alanine transferase, ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transferase，AST)和γ-谷氨酰轉肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase, GGT)采用Hitachi 7 600全自動生化分析儀及其配套試劑檢測；正常參考值分別為(9～50)IU/L、(15～40)IU/L和(10～60)IU/L。外周血血小板(platelet, PLT) 采用Sysmex-XT 4 000i全自動血細胞分析儀檢測，正常參考值(125～350)×109/L。

(四) 統計學方法

數據分析和圖形制作采用Medcalc 15.8軟件。隨訪終點與隨訪起點患者APRI、GPR和FIB-4及其構件之間的差異比較采用兩配對樣本Wilcoxon檢驗。隨訪終點有SINIR與無SINIR、有EXNIR與無EXNIR、有SIFR與無SIFR和有EXFR與無EXFR患者APRI、GPR和FIB-4及其構件之間的差異比較采用兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。隨訪終點與隨訪起點患者肝臟病理學分級和分期構成之間的差異比較采用Pearsonχ2檢驗。隨訪終點有SINIR與無SINIR和有EXNIR與無EXNIR患者肝臟病理學分期構成之間、有SIFR與無SIFR和有EXFR與無EXFR患者肝臟病理學分級構成之間的差異比較采用Pearsonχ2檢驗。隨訪終點患者肝臟病理學分級與分期之間，APRI、GPR和FIB-4及其構件與肝臟病理學分級和分期之間的相關性采用Spearman相關分析；隨訪終點患者肝臟病理學分級和分期，APRI、GPR和FIB-4及其構件與抗病毒治療持續時間之間的相關性采用Spearman相關分析。APRI、GPR和FIB-4及其構件預測SINIR、EXNIR和SIFR、EXFR的性能評價采用ROC曲線法，最佳截斷值的確定參照最大的Youden指數。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗病毒治療期間血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的變化

從隨訪起點到隨訪終點，所有患者HBsAg 均保持陽性，隨訪終點與隨訪起點患者中位HBsAg水平之間的差異無統計學意義(P>0.05)；隨訪終點患者HBeAg 消失率和轉換率均顯著高于隨訪起點患者(P均<0.0001)；隨訪終點患者HBV DNA 不可檢測率顯著高于隨訪起點患者(P<0.0001)；見表1。

二、抗病毒治療期間肝臟壞死炎癥和纖維化的變化

隨訪終點與隨訪起點患者肝臟不同病理學分級和分期構成之間的差異均有統計學意義(P均<0.0001)，見表1和圖1A～1B。

隨訪終點患者病理學分級與分期呈顯著正相關(rs=0.606,P<0.0001)。隨訪終點患者病理學分級和分期與抗病毒治療時間均無顯著相關性(rs=-0.185,P=0.1122和rs=-0.168,P=0.1500)。

隨訪終點有SINIR與無SINIR、有EXNIR與無EXNIR患者病理學分期構成之間的差異均有統計學意義(P均<0.05)；有SINIR的患者中，有SIFR的比例(83.6%, 61/73)與無SIFR的比例(16.4%, 12/73)之間的差異有統計學意義(χ2=4.295,P=0.0382)，有EXFR的比例(23.3%, 17/73)與無EXFR的比例(76.7%, 56/73)之間的差異無統計學意義(χ2=0.006,P=0.9363)；有EXNIR的患者中，有SIFR的比例(93.4%, 57/61)與無SIFR的比例(6.6%, 4/61)之間的差異有統計學意義(χ2=27.434,P< 0.0001)，有EXFR的比例(27.9%, 17/61)與無EXFR的比例(72.1%, 44/61)之間的差異無統計學意義(χ2=3.581,P=0.0585)；見圖1C～1D。

隨訪終點有SIFR與無SIFR患者病理學分級構成之間的差異有統計學意義(P<0.0001)，有EXFR與無EXFR患者病理學分級構成之間的差異無統計學意義(P>0.05)；有SIFR的患者中，有SINIR的比例(100.0%, 61/61)和無SINIR的比例(0.0%, 0/61)之間的差異有統計學意義(χ2=4.295,P=0.0382)，有EXNIR的比例(93.4%, 57/61)和無EXNIR的比例(6.6%, 4/61)之間的差異有統計學意義(χ2=27.434,P< 0.0001)；有EXFR的患者中，有SINIR的比例(100.0%, 17/17)和無SINIR的比例(0.0%, 0/17)之間的差異無統計學意義(χ2=0.006,P=0.9363)，有EXNIR的比例(100.0%, 17/17)和無EXNIR的比例(0.0%, 0/17)之間的差異無統計學意義(χ2=3.581,P=0.0585)；見圖1E～1F。

三、抗病毒治療期間ALT、AST、GGT和PLT的變化

隨訪終點與隨訪起點患者中位ALT、AST、GGT和PLT之間的差異均有統計學意義(P均<0.0001)，見表1。

表1 研究對象的臨床、實驗室和病理學特征

M：中位值；IQR：四分位距；Rang：全距；LLD：檢測下限；a：Pearsonχ2檢驗；b：兩配對樣本Wilcoxon檢驗。

圖1隨訪起點(BOF)和隨訪終點(EOF)肝臟不同病理學分級(Grade)和分期(Stage)的頻數分布 SINIR：顯著壞死炎癥回歸；EXNIR：廣泛壞死炎癥回歸；SIFR：顯著纖維化回歸；EXFR：廣泛纖維化回歸。

隨訪終點患者ALT、AST和GGT與病理學分級均無顯著相關性(rs=0.119,P=0.3086,rs=0.179,P=0.1248 和rs=0.138,P=0.2368)，與病理學分期均無顯著相關性(rs=0.080,P=0.4947,rs=0.130,P=0.2676和rs=0.055,P=0.6367)；PLT與病理學分級和分期均呈顯著負相關(rs=-0.342,P=0.0027和rs=-0.265,P=0.0216)。隨訪終點患者ALT、AST、GGT和PLT與抗病毒治療時間均無顯著相關性(rs=0.044,P=0.7077,rs=0.101,P=0.3892,rs=-0.109,P=0.3518和rs=-0.119,P=0.3077)。

隨訪終點有SINIR與無SINIR患者中位ALT、AST、GGT和PLT之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)；有EXNIR與無EXNIR患者中位ALT、AST和GGT之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)，中位PLT之間的差異有統計學意義(P<0.005)；見表2。

隨訪終點有SIFR與無SIFR患者中位ALT、AST和GGT之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)，中位PLT之間的差異有統計學意義(P<0.01)；隨訪終點有EXFR與無EXFR患者中位ALT、AST、GGT和PLT之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)；見表3。

四、抗病毒治療期間APRI、GPR和FIB-4的變化

隨訪終點與隨訪起點患者中位APRI、GPR和FIB-4之間的差異均有統計學意義(P均<0.0001)，見表1。

隨訪終點患者APRI、GPR和FIB-4與病理學分級均呈顯著正相關(rs=0.310,P=0.0069,rs=0.319,P=0.0053 和rs=0.375, 0.0009)；APRI和FIB-4與病理學分期均呈顯著正相關(rs=0.236,P=0.0414和rs=0.232, 0.0456)，GPR與病理學分期無顯著相關性(rs=0.191,P=0.1014)。隨訪終點患者APRI、GPR和FIB-4與抗病毒治療時間均無顯著相關性(rs=0.174,P=0.1350,rs=0.010,P=0.9330和rs=0.215,P=0.0638)。

隨訪終點有SINIR與無SINIR患者中位APRI、GPR和FIB-4之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)，有EXNIR與無EXNIR患者中位APRI、GPR和FIB-4之間的差異均有統計學意義(P均<0.01)；見表2。

隨訪終點有SIFR與無SIFR患者中位APRI、GPR和FIB-4之間的差異均有統計學意義(P均<0.01)，有EXFR與無EXFR患者中位APRI、GPR和FIB-4之間的差異均無統計學意義(P均>0.05)；見表3。

表2 隨訪終點有顯著和廣泛壞死炎癥回歸與無顯著和廣泛壞死炎癥回歸患者APRI、GPR和FIB-4及其構件之間的差異比較

M：中位值；IQR：四分位距；Rang：全距；ND：不確定；a：Pearsonχ2檢驗；b：兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。

表3 隨訪終點有顯著和廣泛纖維化回歸與無顯著和廣泛纖維化回歸患者APRI、GPR和FIB-4及其構件之間的差異比較

M：中位值；IQR：四分位距；Rang：全距；a：Pearsonχ2檢驗；b：兩獨立樣本Mann-WhitneyU檢驗。

五、APRI、GPR、FIB-4和PLT預測肝臟病理學回歸的性能

APRI、GPR、FIB-4及其共享構件PLT預測EXNIR和SIFR的ROC曲線下面積均顯著大于對角參考線下面積(P均≤0.01)，見表4和圖2。

APRI、GPR、FIB-4和PLT預測SINIR的ROC曲線下面積(95%CI)分別為0.582(0.000～1.000)、0.705(0.283～1.000)、0.647(0.112～1.000)和0.507(0.000～1.000)，與對角參考線下面積之間的差異均無統計學意義(Z=0.210,P=0.8336,Z=0.953,P=0.3406,Z=0.540,P=0.5895和Z=0.019,P=0.9850)，見圖2A；預測EXFR的ROC曲線下面積(95%CI)分別為0.598(0.438～0.758)、0.529(0.385～0.674)、0.570(0.417～0.723)和0.595(0.438～0.753)，與對角參考線下面積之間的差異均無統計學意義(Z=1.200,P=0.2301,Z=0.400,P=0.6895,Z=0.895,P=0.3710和Z=1.189,P=0.2345)；見圖2D。

參照本研究資料確定的最佳截斷值和Liu等[14]建議的預測肝纖維化進展的實用截斷值，APRI、GPR和FIB-4預測EXNIR和SIFR的靈敏度相對高于特異度；以本研究資料確定的最佳截斷值為標準，PLT預測EXNIR和SIFR的特異度相對高于靈敏度；見表4。

討 論

Manne等[20]的系統綜述認為，經皮肝活檢觀察到的肝硬化逆轉與CHB顯著的臨床結局改善有關；12～60月的長期抗病毒治療可以使33%～80%(中位值70%)的肝硬化獲得逆轉。但是，肝硬化逆轉的概念一致存在爭議。事實上，肝硬化回轉到正常肝臟難以證明；而且目前采用的所有肝臟病理學評分系統是否可用于肝硬化逆轉的評估尚未被證實[21]。因此，本研究采用一個新的術語，即肝臟病理學回歸，包括壞死炎癥回歸和纖維化回歸，來代替肝硬化逆轉或回歸的概念。

圖2APRI、GPR、FIB-4和PLT預測顯著和廣泛壞死炎癥及纖維化回歸的ROC曲線 A：預測顯著壞死炎癥回歸；B：預測廣泛壞死炎癥回歸；C：預測顯著纖維化回歸；D：預測廣泛纖維化回歸

表4 APRI、GPR、FIB-4和PLT預測廣泛壞死炎癥回歸和顯著纖維化回歸的性能

AUROC：ROC曲線下面積；Sen：靈敏度；Spe：特異度；PPV：陽性預測值；NPV：陰性預測值；Acc：準確度。a：根據本文資料確定的截斷值；b：根據Liu等[14]的研究預設的截斷值。

根據本文資料，HBeAg陽性的乙型肝炎肝硬化，在經歷12～57月(中位值30月)的長期抗病毒治療后，分別有97.3%和81.3%的患者獲得了SINIR和EXNIR，同時分別有81.3%和22.7%的患者獲得了SIFR和EXFR。本文結果顯示，隨訪終點患者肝臟病理學分級與分期呈顯著正相關；有SINIR和有EXNIR的患者中，有SIFR的比例均顯著高于無SIFR的比例，但是，有EXFR的比例與無EXFR的比例之間無統計學差異；有SIFR的患者中，有SINIR和有EXNIR的比例分別顯著高于無SINIR和無EXNIR的比例；但是，有EXFR的患者中，有SINIR和有EXNIR的比例分別與無SINIR和無EXNIR的比例之間無統計學差異。提示抗病毒誘導的肝臟壞死炎癥回歸是導致肝硬化SIFR的一個前提條件[20]，但不是實現EXFR的充分決定因素。促成EXFR還需要肝細胞再生和肝小葉重建機制的共同參與[21]。

近年來，有少數研究描繪了涵蓋小比例肝硬化的CHB患者在長期抗病毒治療期間的動態變化或抗病毒治療前后一些無創指標如肝臟硬度(liver stiffness measurement, LSM)、APRI和FIB-4的變化[11-16]。這些研究展示了相似的結果，即LSM、APRI和FIB-4在抗病毒治療期間逐步下降或抗病毒治療后顯著下降；也存在共同的限制，即缺少抗病毒治療后的再次病理學評估[11-15]或僅少數患者進行了再次病理學評估[16]。最近，Liang等[17]根據一個164例CHB患者隊列，展現了LSM在抗病毒治療開始后的先快后慢下降模式；提示CHB患者在抗病毒治療開始后的肝臟病理學回歸表現為先壞死炎癥回歸、后纖維化回歸的過程。Wang等[22]根據一個131例CHB患者隊列，發現了幾丁質酶-3樣1不僅在抗病毒治療后顯著下降，而且在抗病毒治療前后均與CPA呈顯著正相關；提示幾丁質酶-3樣1不僅可用于預測抗病毒治療前的纖維化進展，而且可用于預測抗病毒治療后的纖維化回歸。但是，迄今為止，CHB患者在長期抗病毒治療期間肝纖維化回歸的所有無創預測研究，均未涉及到相關的無創指標預測乙型肝炎肝硬化肝纖維化回歸的性能評價。

本文結果顯示，APRI、GPR和FIB-4的非共享構件ALT、AST和GGT與隨訪終點患者肝臟病理學分級和分期均無顯著相關性，中位ALT、AST和GGT在有SINIR與無SINIR、有EXNIR與無EXNIR之間和有SIFR與無SIFR、有EXFR與無EXFR之間的差異均無統計學意義。但是，APRI、GPR和FIB-4及其共享構件PLT與隨訪終點患者肝臟病理學分級均有顯著相關性，APRI、FIB-4和PLT與隨訪終點患者肝臟病理學分期有顯著相關性；中位APRI、GPR、FIB-4和PLT在有EXNIR與無EXNIR之間和SIFR與無SIFR之間的差異均有統計學意義，但在有SINIR與無SINIR之間和有EXFR與無EXFR之間的差異均無統計學意義。提示APRI、GPR和FIB-4及其共享構件PLT對長期抗病毒治療期間EXNIR和SIFR有潛在的預測價值。

本文的ROC曲線分析進一步證實了APRI、GPR、FIB-4和PLT對EXNIR和SIFR有顯著的預測意義。巧合的是，本文根據小樣本確定的APRI和GPR預測HBeAg陽性肝硬化EXNIR和SIFR的最佳截斷值與我們最近發表的根據大樣本確定的APRI和GPR預測HBeAg陰性CHB纖維化進展的實用截斷值非常接近[10]；采用本文確定的最佳截斷值和我們最近確定的實用截斷值，APRI、GPR、FIB-4預測肝硬化EXNIR和SIFR的特異度和靈敏度也基本一致。所不同的是，以我們最近確定的實用截斷值為標準，APRI、GPR、FIB-4預測抗病毒誘導的肝硬化EXNIR和SIFR的靈敏度超過80%，但肝硬化被誤診為EXNIR和SIFR的幾率不低于40%；APRI、GPR、FIB-4預測抗病毒初治的肝硬化的特異度超過65%，且肝硬化被漏診為非肝硬化的幾率低于25%。相反，以本文確定的最佳截斷值為標準，PLT預測EXNIR和SIFR的靈敏度超過65%，但肝硬化被誤診為EXNIR和SIFR的幾率低于30%。

綜上，本文初步探討了長期抗病毒治療期間APRI、GPR和FIB-4及其構件預測乙型肝炎肝硬化肝臟病理學回歸的性能。APRI、GPR和FIB-4的非共享構件ALT、AST和GGT對肝硬化病理學回歸無預測意義；APRI、GPR和FIB-4及其共享構件PLT對肝硬化EXNIR和SIFR有顯著的預測價值。