CRMP3在青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織中的表達研究

覃璐 余瑞杭 蔣艷

[摘要] 目的 探討CRMP3在青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織中的表達情況。 方法 將收集的青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織及腦外傷術后正常腦組織標本分為皮質發育障礙組（MCD組，n=15）和對照組（control組，n=11）。采用實時定量PCR方法檢測CRMP3基因表達情況，采用Western-blot及免疫組化方法檢測兩組之間CRMP3的蛋白質表達水平。 結果 實時定量PCR結果提示CRMP3的mRNA表達水平在MCD組中表達增高，差異有統計學意義（P<0.05）。Western-blot及免疫組化結果提示在MCD組中CRMP3蛋白表達水平較control組顯著上調，且CRMP3主要表達于神經元細胞質中（P<0.05）。 結論 CRMP3在青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織中高表達，可能與皮質發育障礙型癲癇的發生發展具有相關性。

[關鍵詞] 皮質發育障礙;癲癇;CRMP3;青少年

[中圖分類號] R742.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）19-0018-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of CRMP3 in brain tissues of adolescents with epilepsy induced by cortical developmental disorder. Methods The collected brain tissues of adolescents with epilepsy induced by cortical developmental disorder and normal specimens of brain tissue after the surgery of brain trauma were divided into cortical developmental disorder group （MCD group， n=15） and control group （control group， n=11）. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of CRMP3 gene. The protein expression level of CRMP3 between the two groups was detected by Western-blot and immunohistochemistry. Results According to the real-time quantitative PCR results， the expression of CRMP3 gene was increased in the MCD group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. According to the Western-blot and immunohistochemistry results， the expression level of CRMP3 protein was significantly up-regulated in the MCD group compared with the control group， and CRMP3 was mainly expressed in neuronal cytoplasm（P<0.05）. Conclusion CRMP3 is highly expressed in the brain tissues of adolescents with epilepsy induced by cortical developmental disorder， which may be related to the occurrence and development of epilepsy induced by cortical developmental disorder.

[Key words] Cortical developmental disorder; Epilepsy; CRMP3; Adolescent

皮質發育障礙（malformations of cortical development，MCD）是中樞神經系統發育畸形而導致的一種疾病，包括局灶性皮質發育不良（focal cortical dysplasia，FCD）、結節性硬化（tuberous sclerosis complex，TSC）、無腦畸形等亞型[1，2]。MCD可導致癲癇發作，且是難治性癲癇的常見原因之一。研究認為MCD致癇的主要原因是異構神經元的過度興奮及異常神經通路的形成[3，4]。

腦衰反應調節蛋白家族（CRMPs）控制著神經元樹突、軸突的形態發展，神經元的極化以及神經干細胞的分化[5，6]。相關研究發現CRMP3能夠促進神經元樹突的生長，體內外實驗證實敲除CRMP3可引起樹突形態發育不良[7，8]。眾多研究表明，CRMP3蛋白的異常表達與神經系統疾病具有相關性，如腦缺血[9]、邊緣性腦炎[10]、副腫瘤綜合征[11]等。但是，目前CRMP3與皮質發育障礙型癲癇的研究尚為空白。

本實驗以青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織及腦外傷術后正常腦組織為對象，運用實時定量PCR、Western Blot、免疫組化方法探索CRMP3在MCD型癲癇腦組織中的表達差異，從而初步探討CRMP3與皮質發育障礙型癲癇的相關性以及其潛在的病理機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源

腦組織標本均由第三軍醫大學新橋醫院提供，標本的采集得到了新橋醫院倫理委員會的批準以及患者家屬的同意。MCD型癲癇腦組織標本（MCD組）來源于MCD型癲癇患者手術，共15例，其中男8例，女7例，平均年齡（12.22±3.20）歲。正常腦組織標本（control組）由腦外傷后因顱內高壓手術切除而來，共11例，其中男7例，女4例，平均年齡（13.10±3.70）歲，且所提供標本的患者既往均無神經系統疾病及癲癇病史。兩組患者均為漢族，在性別、年齡方面差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2主要試劑

TRIzol購自Invitrogen公司，蛋白質濃度測試劑購自Bradford公司，CRMP3引物購自Origene公司，總RNA提取試劑盒購自碧云天公司，CRMP3及GADPH抗體購自Abcam公司。

1.3 實時定量PCR

采用TRIzol試劑（1 mL/60 mg）提取腦組織中的總RNA。將所獲得的RNA通過A3500逆轉錄儀使其反轉錄為cDNA。cDNA通過ABI 7500 Real-Time PCR儀對目的引物CRMP3進行PCR擴增。本實驗以GADPH為內參，運用2-△△Ct方法分析CRMP3基因表達的相對定量，至少重復3次實驗。

1.4 蛋白質免疫印跡

將腦組織標本勻漿后加入蛋白質裂解液從而提取其總蛋白質，用BCA方法測得濃度。蛋白變性后，于對應孔中分別加入40 μg蛋白，經SDS-PAGE電泳分離，并轉至PVDF膜。4%明膠室溫封閉1 h，一抗（兔多克隆CRMP3抗體，1：2000）4℃過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1：5000），室溫孵育 1 h后，ECL發光顯色。Quantity One軟件分析目的條帶光密度值（OD值），至少重復3次實驗。

1.5 免疫組化

腦組織樣本用多聚甲醛浸泡過夜，石蠟包埋。經脫蠟、水化后，切片經pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液加熱，從而達到修復抗原作用。切片冷卻后，加入H2O2滅活內源性過氧化物酶。山羊血清封閉液室溫孵育30 min，CRMP3抗體（1：500稀釋）4℃過夜。次日，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木精復染，再次脫水后用光學顯微鏡拍照。

該實驗運用半定量方法分析蛋白質表達水平，免疫組化圖片染色強度得分范圍為0～3分，陽性細胞百分比范圍0～100%，兩者相乘得到結果范圍為0～200[12，13]。通過得分比較可分析出CRMP3的表達情況。該實驗至少進行3次。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時定量PCR檢測CRMP3 mRNA的表達情況

MCD組中CRMP3的mRNA表達水平（2.23±0.14）顯著高于control組（0.98±0.19），差異有統計學意義（P<0.05）（圖1）。

2.2 蛋白質免疫印跡檢測CRMP3在各組中的表達情況

通過Western-blot方法發現：與control組（0.87±0.31）相比，CRMP3在MCD組中的表達（2.26±0.29）明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.3 免疫組化檢測CRMP3的表達情況及其分布

利用免疫組化方法檢測CRMP3在青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織中的表達情況。與control組（21.14±4.94）相比，CRMP3在MCD組（181.01±6.43）表達上調，差異有統計學意義（P<0.05），且主要表達于神經元細胞質中（封三圖3）。

3討論

皮質發育障礙型癲癇為藥物難治型癲癇種類之一，目前主要通過手術切除致癇灶方式加以治療[14]。但是，外科手術不僅加重了患者的經濟負擔，而且手術本身也是一種創傷。目前普遍研究認為，MCD是由于神經元異常增殖凋亡、神經元遷移及皮層重構異常導致[15]。MCD病理學常表現為大量異形及巨形神經元、氣球樣細胞及巨細胞，這些細胞又稱為異構神經元。研究發現這些異構神經元具有高度興奮性，可自發產生癇樣放電[16]。

樹突的異常生長、突觸的畸形重組不僅會導致神經元及皮層重構異常產生MCD，而且通過新形成的神經環路，導致癇樣放電[17]。CRMPs是在1995年通過Sema 3A信號通路而被大眾所認識，共包括5個成員（即CRMP1～5）[18-20]。強有力的證據表明CRMPs主要通過微管聚合、微絲運動、肌動蛋白網絡形成從而調控細胞骨架，參與神經細胞分化、遷徙及神經突起的生長發育[21，22]。CRMP1的表達能夠抑制神經突起的生長及分支形成[23]。2012年研究發現CRMP1在成年人顳葉難治性癲癇腦組織中表達下調，證實CRMP1與顳葉難治性癲癇具有相關性[24]。CRMP3作為 CRMPs家族成員之一，Quach TT等[7，8]發現CRMP3在樹突及軸突形態發育上起著重要作用，在小鼠體內敲除CRMP3可導致樹突形態發育不良，在體外實驗發現CRMP3可通過調節離子門控通道從而影響樹突形態發育。Aylsworth A等[25]發現CRMP3通過阻止微管蛋白的聚合從而調控神經元的生長。2013年，有報道提出CRMP3參與調節神經元死亡[26]。因此，我們推測CRMP3通過樹突及神經元的異常延伸，參與皮質發育障礙型癲癇的發生機制。

通過本實驗，發現在MCD組中，CRMP3的mRNA水平表達較conrtol組明顯升高。在MCD型癲癇腦組織中CRMP3的蛋白水平表達同樣高于正常腦組織。研究結果證實CRMP3的高表達與青少年皮質發育障礙型癲癇的發生發展具有相關性。但是，本研究只是一種現象存在，CRMP3是否引起MCD型癲癇的發生，尚需進一步研究證實。

綜上所述，本實驗研究了CRMP3在青少年皮質發育障礙型癲癇腦組織中的表達情況，結果提示CRMP3與皮質發育障礙型癲癇具有相關性，該結果為進一步研究皮質發育障礙型癲癇的機制奠定了基礎，為新藥物的研究提供了一個新的方向。

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（收稿日期：2019-02-26）