網絡藥理學探究神效瓜蔞散治療乳腺癌作用機制

付精精，吳雄志

（天津醫科大學腫瘤醫院中西醫結合科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

乳腺癌是世界范圍內確診率最高的癌癥，每年新增病例167萬例，死亡人數超過50萬[1]，據報道，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因[2]，中國女性新診斷的癌癥中有15%是乳腺癌[3]，其中75%的乳腺癌是雌激素ER陽性[4]。中醫是我國的傳統醫學，中草藥常用來治療不同類型癌癥，不僅可以減輕癌癥疼痛、嘔吐、腹瀉、疲乏、白細胞減少等化療副作用，還有抗增殖、抗遷移等作用，可以提高患者生存率[5-7]。神效瓜蔞散是傳統的中藥方劑，來源自宋·陳自明的婦科著作《婦人良方》，由瓜蔞、甘草、當歸、乳香、沒藥組成，主治乳癰及一切癰疽初起，其中“乳癰”為古代文獻常見的類似乳腺癌表現疾病，故選取神效瓜蔞散研究其抗乳腺癌的作用機制。網絡藥理學是基于生物分子網絡構建“藥物-靶點-通路”多層次網絡分析藥效活性成分和可能的分子網絡機制,旨在建立中藥及其復方多成分、多途徑、多靶點間的協同作用聯系[8-10]。本文將進行體外實驗驗證神效瓜蔞散對乳腺癌的抑制作用，再運用網絡藥理學的思路和方法,預測神效瓜蔞散作用于乳腺癌的靶點,運用Western驗證蛋白，探討神效瓜蔞散作用乳腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 神效瓜蔞散的瓜蔞、甘草、當歸、乳香和沒藥均購買自北京同仁堂大藥房。藥物經過浸泡、煮沸、過濾、旋蒸、凍干等步驟得到神效瓜蔞散的水提物。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞系SKBR-3細胞培養在含10%胎牛血清的1640培養基于37℃，95%的空氣和5%CO2的飽和濕度下培養。SKBR-3購買自中國科學院腫瘤細胞庫。

1.2.2 細胞增殖實驗 細胞增殖試驗采用臺盼藍染色法和MTS法檢測細胞存活和增殖情況。臺盼藍染色法是對數增長的乳腺癌SKBR-3細胞1×104/孔密度鋪在24孔板培養，設置空白對照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300 和 400 μg/mL），細胞計數使用0.4%的臺盼藍計數。MTS法將對數增長的乳腺癌SKBR-3細胞1×104/mL鋪在96孔板培養，設置空白對照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300和400μg/mL），每孔加入 20μLMTS，用美國 Bio-Rad微孔板光度計在490 nm處測定吸光度（OD）值。

1.2.3 劃痕實驗 細胞劃痕實驗將對數增長的乳腺癌SKBR-3細胞（10×104）鋪在24孔板培養，設置空白對照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300和400μg/mL），劃痕分別在0、6、12、24和48h拍照。

1.2.4 Western blot實驗 對數增長的乳腺癌SKBR-3細胞（20×104）鋪在6孔板培養，設置空白對照組、神效瓜蔞散劑量組（100、200 μg/mL），收集培養72 h后的細胞,裂解細胞提取蛋白。采用Western blot法檢測ERα的表達水平,以β-actin為空白對照,操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 網絡藥理學方法

1.3.1 藥物有效成分的收集和靶點預測 通過先前研究[11]，神效瓜蔞散的5個藥物成分分別從TCMSP數據庫、TCMID數據庫等數據庫查找有效成分，其中按照類藥性＞0.18篩選有效成分，再通過pubchem、drugbank、chemmapper等數據庫根據藥物結構的相似性找到有效成分相應靶點。

1.3.2 乳腺癌的靶點預測 乳腺癌的靶點通過網絡數據庫 TTD（Therapeutic Target Database）和 Pubmed、知網等數據庫文獻中篩選。

1.3.3 網絡構建和分析 將預測到神效瓜蔞散的有效成分的靶點和乳腺癌的預測靶點進行匹配，并通過Cytoscape軟件,根據成分與靶點關聯的程度、匹配的程度制作對應中藥的成分-靶點網絡圖，并對其進行歸納和總結。

1.4 統計學分析 圖標使用Excel、PowerPoint和GraphPad Prism 5生成圖形。使用社會科學SPSS12.0的統計軟件包確定統計顯著性。

2 結果

2.1 神效瓜蔞散水提物的提取結果 買自北京同仁堂的神效瓜蔞散240 g經過浸泡、煮沸、過濾、旋蒸、凍干等步驟得到110 g神效瓜蔞散水提物。

2.2 細胞增殖實驗結果

2.2.1 臺盼藍法結果 使用臺盼藍法加入不同劑量神效瓜蔞散（50、100、200 、300 和 400 μg/mL）后，連續計數乳腺癌SKBR-3細胞6 d，觀察不同劑量組細胞數目變化和差異，發現在劑量為50 μg/mL的低劑量組就出現細胞數目的明顯減少，并且呈劑量依賴性，且在第3天細胞數目開始明顯減少，呈時間依賴性（P＜0.05），見圖1。

圖1 SKBR-3細胞在不同劑量藥物臺盼藍計數Fig 1 SKBR 3 cells trypan blue countings at different doses

2.2.2 MTS法結果 MTS實驗設置空白對照組、不同劑量神效瓜蔞散（50、100、200、300 和 400 μg/mL）組后，72hOD值見圖2，從圖中可以看出，隨著神效瓜蔞散濃度的增加，OD值呈劑量依賴性下降（P＜0.05）。

圖2 SKBR-3細胞在不同劑量組藥物MTS的OD值Fig 2 OD value of the MTS for SKBR 3 cells at different dose drugs

臺盼藍法和MTS實驗說明神效瓜蔞散能夠抑制乳腺癌細胞SKBR-3增殖，且呈劑量、時間依賴性。2.3 劃痕實驗結果 為了初步探索神效瓜蔞散與乳腺癌SKBR-3細胞遷移的關系，采用劃痕實驗方法。劃痕實驗設置對照組、不同劑量神效瓜蔞散（100、200 μg/mL）組后，24 h 實驗結果見圖 3，從圖中可以看出和空白對照組相比，各加藥組細胞遷移的距離明顯減少，說明神效瓜蔞散能夠抑制乳腺癌細胞SKBR-3的遷移，且呈劑量依賴性。

圖3 SKBR-3細胞在不同劑量組藥物的24 h劃痕（4×100）Fig 3 SKBR 3 cell scratches at different doses for 24 h（4×100）

2.4 網絡藥理學結果

2.4.1 藥物有效成分的收集和靶點預測結果 神效瓜蔞散的瓜蔞、甘草、當歸、乳香和沒藥5個成分，通過TCMSP數據庫、TCMID數據庫等數據庫，按照類藥性＞0.18篩查到的有效成分及通過pubchem、drugbank、chemmapper等數據庫找到藥物的有效成分和靶點情況見表1。

表1 神效瓜蔞散組分的有效成分、預測靶點結果Tab 1 Active ingredients in Shenxiaogualousan and its predicted target results

2.4.2 乳腺癌的靶點預測結果 乳腺癌通過TTD數據庫篩選到靶點80個，通過Pubmed、知網等數據庫文獻查找到41個靶點，所以乳腺癌的靶點一共121個。

2.4.3 網絡構建和分析結果 通過神效瓜蔞散的有效成分和預測靶點與乳腺癌的靶點匹配后，用Cytoscape軟件構建的神效瓜蔞散成分靶點網絡圖見圖4，從圖中可見神效瓜蔞散靠前的靶點是ER、HSP90等，可以推測神效瓜蔞散通過ER、HSP90等靶點作用于乳腺癌發揮其抗腫瘤作用。

圖4 神效瓜蔞散的成分靶點網絡圖Fig 4 Target network diagram for Shenxiaogualousan ingredients

2.5 神效瓜蔞散對ERα作用結果 網絡藥理學分析神效瓜蔞散可能主要通過作用于ER發揮抗乳腺癌作用，為此筆者檢測了神效瓜蔞散作用的乳腺癌細胞SKB的ERα的表達以驗證網絡藥理學分析的預測結果。結果顯示：加入不同濃度的神效瓜蔞散（0、100、200 μg/mL）后，隨著藥物劑量的增加，ERα逐漸減少（P＜0.05），見圖 5。Western blot實驗結果與網絡藥理學預測機制部分吻合。

圖5 神效瓜蔞散對乳腺癌細胞SKB的ERα表達的影響Fig 5 Shenxiaogualousan impact on breast cancer cells of SKB expression of ER alpha

3 討論

通過實驗結果表明，神效瓜蔞散能夠在體外抑制乳腺癌細胞SKBR-3的增殖和遷移，并且呈劑量依賴性。網絡藥理學建立的成分靶點圖，排在前兩位分別是ER、HSP90。

乳腺癌是世界范圍內確診率最高的癌癥，其中75%的乳腺癌是雌激素ER陽性，雌激素長期過度刺激、ER表達水平增高或轉錄激活活性增強，是導致乳腺癌的重要原因[13]，1896年,Beatson醫生首先對乳腺癌患者進行了卵巢切除術,開創了針對雌激素治療的先河。如今ER受體已經是乳腺癌內分泌治療的作用靶點，是乳腺癌治療的主要方法之一，多數臨床研究結果顯示內分泌輔助治療可以顯著降低乳腺癌復發率并延長生存期。雌激素的生物學效應主要通過雌激素受體介導的對下游靶基因轉錄激活或抑制效應來實現，雌激素有兩個受體,ERα與ERβ,研究表明在乳腺中以ERα為主,ERα過度激活是雌激素依賴性乳腺癌發生與進展的重要因素[12]。雌激素的核受體按照結構和功能主要分為2類：類固醇激素受體家族和甲狀腺受體家族，類固醇激素受體未活化狀態時與熱休克蛋白結合存在，配體與受體結合使熱休克蛋白與受體解離[13]。

熱休克蛋白（HSP）是高度保守的應激蛋白，在細胞中作為分子伴侶參與蛋白質的折疊、轉運、逆轉錄許多關鍵調節因子的蛋白水解過程,從而影響細胞生長、分化和生存[14-15]。熱休克蛋白通常按照分子量不同，分為HSP70和HSP90，其中HSP90又分為HSP90α和HSP90β兩種亞型，兩者同源性高達84%，其中HSP90在雌激素的信號傳導中起重要作用即當雌激素受體未與雌激素結合時，細胞內的ER和HSP90形成ER-HSP 90復合物,雌激素和ER結合后，HSP90分離,雌激素受體激活發揮生物學效應[15]。研究表明，HSP90的過高水平的表達與乳腺癌患者的不良預后相關[16]。

神效瓜蔞散從宋代以來就用來治療乳腺癌，本研究利用網絡藥理學的方法，發現其發揮抗乳腺癌作用可能主要是通過內分泌通路，今后可以進一步研究神效瓜蔞散通過內分泌通路治療乳腺癌的具體機制以及可能存在的其他抗乳腺癌的通路。