Ku70蛋白的翻譯后修飾在腫瘤研究中的進展

劉 壯 綜 述，吳志強，袁智勇 審 校

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院放療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室,天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300060）

Ku70是一個分子量大約70KD的蛋白，在許多細胞信號通路中發(fā)揮著重要作用。在DNA雙鏈斷裂非同源末端連接修復(fù)通路中，Ku70和其家族成員蛋白Ku80形成異二聚體戒指樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與DNA雙鏈斷裂的斷端結(jié)合，從而促進DNA損傷修復(fù)[1-2]，增強腫瘤放療抵抗。在Ku70參與的Bax介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路中，Ku70可以和Bax結(jié)合，抑制了Bax向線粒體轉(zhuǎn)移，從而抑制線粒體細胞凋亡通路[3]，抑制腫瘤細胞凋亡。Ku70還參與到端粒的維持，通過保護染色體末端，防止被DNA修復(fù)通路錯誤識別切割，從而維持了基因的完整性。另外，在DNA復(fù)制過程中，Ku70也發(fā)揮著不可替代的作用。這些功能都與Ku70蛋白的翻譯后修飾密切相關(guān)（圖1，表1）。

表1 Ku70的翻譯后修飾

翻譯后修飾（post-translational modification,PTMs）是一種氨基酸的化學(xué)修飾，例如磷酸化、乙酰化、泛素化、類泛素化等。幾乎所有的蛋白都可以發(fā)生翻譯后修飾，蛋白的翻譯后修飾對蛋白的生物學(xué)功能有著重要的影響，比如蛋白的定位，生物活性調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性等[4]。翻譯后修飾在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展以及其它生理、病理過程中，均發(fā)揮著重要作用。

到目前為止，大量的研究表明，Ku70的翻譯后修飾在腫瘤細胞的增殖、DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用。本文著重對Ku70蛋白的翻譯后修飾在腫瘤研究中的進展進行綜述，為腫瘤的防治提供新思路。

1 Ku70蛋白的翻譯后修飾及其作用

1.1 磷酸化修飾 近幾年來，很多腫瘤相關(guān)研究證實了Ku70蛋白許多位點的磷酸化（圖1、表1），在腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)以及細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。在真核細胞中，DNA雙鏈斷裂是DNA損傷最嚴重的形式。DNA雙鏈斷裂如果不能及時并正確的修復(fù)就會引起細胞死亡或者突變，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。在腫瘤治療中，放療主要通過引發(fā)DNA雙鏈斷裂殺死腫瘤細胞，而部分化療藥物在一定程度上也依賴藥物引起的DNA雙鏈斷裂阻斷腫瘤細胞的增殖或誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡。因此，DNA損傷修復(fù)是腫瘤細胞產(chǎn)生放化療抵抗的一個重要原因[6]。DNA雙鏈斷裂的修復(fù)方式主要包括兩種：同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)[7-9]。非同源末端連接修復(fù)由于不需要同源模板，可直接將斷裂的斷端進行連接，同時可以發(fā)生在細胞周期的任何一個時期，因此成為DNA損傷的主要修復(fù)方式[5]。

Ku70是DNA損傷非同源末端連接修復(fù)通路中的重要分子。在非同源末端連接修復(fù)過程中，Ku70和Ku80迅速結(jié)合到斷裂的雙鏈DNA斷端，保護DNA末端，同時募集下游分子蛋白和酶類，包括DNA依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase subunit,DNA-PKcs）、Artemis酶、X 射線修復(fù)交叉互補蛋白4(X-ray cross-complementing group 4,XRCC4)、XRCC4 類似因子（XLF）、DNA 連接酶4（Lig4）等，促進修復(fù)的順利完成[1-2]。在腫瘤細胞中，當DNA發(fā)生雙鏈斷裂時，Ku70的S27和S33位點可以被DNA-PKcs或ATM磷酸化，進而促進腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)及細胞增殖[10]。Ku70的S155位點也可以被ATM或DNA-PKcs磷酸化，此位點的磷酸化可以增加凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ATF2(activating transcription factor 2)的磷酸化，進一步促進腫瘤細胞凋亡[11]。另外S155位點磷酸化的Ku70還可以通過抑制Aurora B激酶的活性，引起的腫瘤細胞周期停滯[12]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在Ku70分子的“間橋和支柱”區(qū)域有5個磷酸化位點，分別是T305、S306、T307、S314 和 T316，這 5 個位點的磷酸化與Ku70的粘附DNA的能力密切相關(guān)，在細胞周期S期，它們的磷酸化促進了Ku70與DNA雙鏈斷裂斷端的分離，從而使DNA雙鏈斷裂修復(fù)在S期更傾向于選擇同源重組修復(fù)[13]。

Ku70的磷酸化修飾還可以調(diào)節(jié)Ku70和Bax親和力，由于Bax蛋白與細胞凋亡通路密切相關(guān)，因此Ku70的磷酸化也在腫瘤細胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，當Ku70的S6和S51發(fā)生磷酸化時，Ku70和Bax親和力下降，從而引發(fā)Bax向線粒體轉(zhuǎn)移，促進腫瘤細胞凋亡[14]。另外，研究者新發(fā)現(xiàn)了Ku70的Y530位點磷酸化可抑制K539和K542的乙酰化,間接增強Ku70結(jié)合Bax的能力，從而抑制Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡[15]。因此抑制Ku70的Y530位點的磷酸化，促進腫瘤細胞凋亡，是一個潛在的腫瘤的治療靶點。

在腫瘤細胞DNA復(fù)制過程中，Ku70可以被細胞周期蛋白激酶磷酸化，參與到DNA復(fù)制的起始，保證了腫瘤細胞DNA復(fù)制的正常進行。在細胞周期G1期，非磷酸化的Ku70可以結(jié)合到DNA復(fù)制的起始部位，與Ku80共同募集DNA復(fù)制識別起始復(fù)合物，為下一步DNA復(fù)制做好準備。當細胞周期進入S-M期時，Ku70蛋白的T401、T428和T455位點受到細胞周期蛋白激酶如周期蛋白A1-CDK2、A2-CDK2等磷酸化，引起Ku70/80的脫落，從而避免了DNA重復(fù)復(fù)制[16]。另外，Ku70的T58位點也可以被細胞周期激酶E1-CDK2磷酸化[16]，該位點的磷酸化可能有另外的功能，需要進一步研究。

1.2 乙酰化修飾 在非同源末端連接修復(fù)中，Ku70和Ku80首先發(fā)現(xiàn)并粘附到斷裂的雙鏈DNA斷端對于起始非同源末端連接修復(fù)至關(guān)重要。而Ku70的乙酰化對其粘附活性有重要影響。有研究者探究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞核中，Ku70的K282、K338、K539和K542位點（圖1，表1）的乙酰化受到組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的調(diào)節(jié)，這些位點的非乙酰化狀態(tài)增強了Ku70的粘附DNA雙鏈斷端的能力，從而增強了腫瘤細胞的抗DNA損傷修復(fù)的能力。因此，運用組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以增加這些位點的乙酰化，有利于提高腫瘤臨床治療的敏感性[17]。然而Ku70的K317和K331以及上邊所提到的K282和K338都位于Ku70的DNA粘附結(jié)構(gòu)域內(nèi)，但是前兩者的乙酰化對Ku70的粘附活性并沒有明顯的影響，它們的乙酰化可能參與Ku70的其他功能，需要進一步探究[17]。在Ku70的核定位信號結(jié)構(gòu)域內(nèi)，存在5 個乙酰化位點（K539，K542，K544，K553 和 K556）（圖1），當腫瘤細胞發(fā)生DNA損傷后，這些位點的乙酰化可能促進細胞質(zhì)內(nèi)的Ku70的入核，參與到DNA損傷修復(fù)中，提高腫瘤細胞抗損傷修復(fù)的能力[18]。

細胞質(zhì)內(nèi)Ku70的乙酰化在Bax介導(dǎo)的線粒體凋亡中發(fā)揮著重要作用。Bax是一個促凋亡蛋白，屬于BCL-2家族蛋白成員，在線粒體凋亡通路中，起著關(guān)鍵性作用[19]。當腫瘤細胞受到凋亡刺激時Bax被激活，活化的Bax發(fā)生一系列構(gòu)象的改變，逐漸聚集到線粒體，在線粒體外膜形成二聚體，或者進一步聚集形成多聚體，最終引起線粒體釋放細胞色素c，誘導(dǎo)細胞的凋亡[20]。但是當細胞在正常生理狀態(tài)下，細胞中存在某些蛋白可以和Bax結(jié)合，從而維持Bax處于失活狀態(tài)[21]。Ku70是第一個被發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合Bax，阻止其向線粒體轉(zhuǎn)移的蛋白，而且Ku70的乙酰化狀態(tài)和去乙酰化狀態(tài)調(diào)節(jié)著Bax的激活和失活狀態(tài)[22]。當Ku70處于去乙酰化狀態(tài)時，就和Bax結(jié)合，形成復(fù)合體，穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中；而Ku70被某些乙酰化酶催化發(fā)生乙酰化后，兩者就會分離，引起B(yǎng)ax激活，從而引起細胞凋亡[22]。近幾年來，研究表明Ku70可以被CBP（the CREB-binding protein，CREB 結(jié)合蛋白）或 PCAF（p300/CBP-assoc iated factor,p300/CBP相關(guān)因子）乙酰化，在腫瘤細胞中高表達CBP可以增加Ku70的乙酰化，相反低表達CBP可以降低Ku70的乙酰化[3，23]。K539和K542位點（圖1）在CBP或PCAF介導(dǎo)的Ku70的乙酰化中起關(guān)鍵作用，研究者突變兩個位點的賴氨酸（K539QandK542Q），發(fā)現(xiàn)完全抑制了Ku70在細胞質(zhì)中阻止Bax介導(dǎo)線粒體凋亡的能力[22，24]。細胞質(zhì)內(nèi)Ku70蛋白的乙酰化水平也受到組蛋白去乙酰化酶的調(diào)節(jié)（HDACs），到目前為止，SIRT1[25]、SIRT3[26]和HDAC6[3]已經(jīng)被證實可以去乙酰化Ku70，從而減少Bax介導(dǎo)的細胞凋亡，當敲低它們的表達或者用特異性的抑制劑能夠增加Ku70的乙酰化，從而增加了Bax介導(dǎo)的細胞凋亡。因此，近幾年來Ku70的組蛋白去乙酰化酶成為腫瘤的治療過程中新靶點[17,27-28]。

1.3 泛素化和SUMO類泛素化修飾 泛素化也是一種常見的翻譯后修飾，幾乎所有的蛋白都會經(jīng)歷泛素化修飾。當?shù)鞍资艿綋p傷，發(fā)生錯誤折疊，或者不再被機體所需要，這些蛋白就會發(fā)生泛素化修飾[29]。以前認為蛋白的泛素化最終結(jié)局是運輸?shù)降鞍酌阁w后降解，現(xiàn)在隨著認識的深入，發(fā)現(xiàn)蛋白的泛素化不僅只是標識著蛋白的降解，對于蛋白的運輸以及功能也有很重要的影響。研究表明，在非同源末端連接修復(fù)后期，RNF126或者SCF復(fù)合體可以使Ku70泛素化，從而使Ku70從DNA上脫離下來，有利于修復(fù)的進一步完成[30-31]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)Ku70 的 vWF（the von Willebrand factor）結(jié)構(gòu)域包含一個泛素化位點（K114）（圖 1，表 1）,此位點的泛素化介導(dǎo)了Ku70以及其他非同源末端連接修復(fù)因子與DNA雙鏈的脫離[32]。Ku70和Ku80結(jié)合的時候，兩者更加穩(wěn)定，當其中任何一種蛋白經(jīng)泛素化降解都不利于形成一個穩(wěn)定的Ku蛋白，因此泛素化直接或間接對Ku70蛋白的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。目前Ku70蛋白的泛素化還需要進一步探究，具體泛素化位點還需要進一步確定，這將會深入認識Ku70泛素化的具體作用，為腫瘤的研究提供新的認識。

SUMO（small ubiquitin-related modifier）是一類重要的類泛素蛋白，在類泛素化E2結(jié)合酶Ubc9以及E3連接酶的共同作用下，連接到蛋白上，參與調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性以及胞內(nèi)定位等生物學(xué)功能[33]。在哺乳動物中，目前發(fā)現(xiàn)至少存在4種SUMO分子，包括SUMO-1，-2，-3和-4[34]。隨著對SUMO類泛素化研究的深入，越來越多的研究表明，SUMO類泛素化修飾在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在人類卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌以及結(jié)直腸癌等腫瘤細胞中，類泛素化E2結(jié)合酶以及E3連接酶存在不同程度的高表達[35]，另外許多腫瘤相關(guān)蛋白如P53、P63以及pRB等也存在著SUMO類泛素化的修飾。因此進一步明確SUMO類泛素化的生物學(xué)功能特點，對腫瘤的治療具有重要意義。近幾年來，相關(guān)研究表明細胞內(nèi)高水平的SUMO-1或SUMO-2使Ku70蛋白更加穩(wěn)定，Ku70的穩(wěn)定性直接增加了Ku70在細胞中的表達水平，而Ku70蛋白自身的SUMO類泛素化修飾卻沒有對其穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響[36]。而在真核單細胞芽殖酵母中的一項研究表明，Ku70蛋白的5個賴氨酸位點（K588、K591、K592、K596、K597） 突變?yōu)榫彼岷螅琄u70蛋白的SUMO類泛素化明顯下調(diào)，進而減弱了Ku70在非同源末端連接中的功能[37]。SUMO類泛素化修飾對Ku70穩(wěn)定性以及功能的影響需要進一步研究。

1.4 其他修飾 Ku70的功能的多樣性，與其翻譯后修飾密切相關(guān)。目前，Ku70蛋白的翻譯后修飾主要集中在以上所述的修飾類型，而其他修飾類型有待深入研究，例如蛋白的糖基化可以影響蛋白在核內(nèi)和質(zhì)內(nèi)的分布；也可以改變蛋白的構(gòu)象，從而影響蛋白與蛋白，蛋白與DNA的相互作用[38]。目前的研究表明，Ku70的ADP-核糖基化作為Ku70蛋白的募集信號，在DNA雙鏈斷裂非同源末端連接修復(fù)中發(fā)揮著重要作用[39]。ADP-核糖基化酶可以與Ku70蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而增強Ku70蛋白和DNA的結(jié)合作用，促進非同源末端連接修復(fù)的進行[40]。在腫瘤的研究過程中，Ku70的這種糖基化修飾在其他功能方面發(fā)揮的作用還不清楚，需要進一步探究,這將為腫瘤的防治提供新思路。

2 結(jié)語

近幾年來，隨著對腫瘤研究的不斷深入，Ku70在腫瘤細胞胞質(zhì)和核內(nèi)的功能逐漸被闡明。Ku70除了在DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接修復(fù)、Bax參與的細胞凋亡、端粒的維持以及DNA復(fù)制等方面發(fā)揮著重要作用外，Ku70本身還具有酶活性，例如Ku70的去泛素化酶活性[41]，Ku70蛋白的其他功能還需要深入研究。Ku70功能的多樣性與翻譯后修飾密切相關(guān),本篇綜述了Ku70的翻譯后修飾在腫瘤研究中的進展情況，表明Ku70的翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO類泛素化等在Ku70相關(guān)信號通路中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，針對Ku70蛋白及其翻譯后修飾為靶點的腫瘤治療，比如Ku70蛋白的抑制劑及其翻譯后修飾抑制劑或者激活劑有望增加腫瘤的治療效果。進一步研究Ku70蛋白及其翻譯后修飾，具體的修飾類型和位點，Ku70蛋白翻譯后修飾的功能改變等，對腫瘤的發(fā)生與治療有重要意義。