氣相色譜法測定藥物中間體2-甲基咪唑中乙醛的殘留量

翁秀芳，董衛莉，張慕軍

（1.天津醫科大學藥學院藥物化學教研室，天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070；2.天津藥物研究院原料藥研究中心，天津300193）

甲硝唑是硝基咪唑類抗生素，具有抗感染的作用，是抗厭氧菌的首選藥物[1]，臨床上多用于抗阿米巴原蟲、抗滴蟲，艱難梭菌感染的腹瀉的治療[2]。二甲硝咪唑對黑頭組織滴蟲、鞭毛蟲等原蟲，及壞死厭氧絲桿菌、腸弧菌等細菌，具有顯著抑制作用。2-甲基咪唑是用于生產甲硝唑和二甲硝唑等藥物的中間體[3-4]，可用作環氧樹脂等固化劑，纖維織品染料的輔助劑，制備泡沫塑料時的添加劑。

以乙醛、乙二醛、氨為原料經Redziszewsk反應，可一步生成2-甲基咪唑，該法反應后，于減壓下濃縮，冷卻至室溫，析出結晶即為產品，經分離后，母液經進一步分離處理也可得到含量約90%的產品。此法反應條件比較溫和，原料易得，工藝簡單，操作方便，設備要求不高，反應收率為80%以上，成本較低，這是目前國內大多數廠家采用的方法。其反應方程式如下[5]：

乙醛是一種無色、有強烈的刺激性氣味易流動液體，易溶于水、醇類等。乙醛是酒精中酵母發酵的中間代謝物，是一種致癌物質[6-7]。研究表明，乙醛的毒性大約是酒精毒性的5.3倍[8]，其能與機體內的各種蛋白質或膜物質結合，形成乙醛-蛋白質加合物而干擾多種酶的催化性質，影響細胞內多種代謝途徑和生物膜的完整性。乙醛與微管的結構蛋白(微管蛋白)的高反應性賴氨酸殘基結合，結果損害了微管的聚合和結構，并抑制了蛋白質、脂蛋白和糖蛋白的分泌[9]。世界衛生組織已經將乙醛列為2類致癌物質清單中。因此，需要對乙醛的殘留量加以控制。由于乙醛為小分子化合物，易揮發，并且在紫外區的吸收較低，無法進行高效液相色譜法檢測。文獻報道乙醛的測定方法主要有衍生化法（液相色譜[10-13]或紫外分光光度計測定[14]）、氣相色譜法（頂空進樣[15-16]）等。衍生化法操作復雜，實驗步驟繁多，且衍生化試劑具有較大毒性，未采用該方法。采用頂空進樣法測定乙醛時，筆者在實驗中發現利用該方法測定乙醛，加樣回收率只有20%～27%。因為乙醛沸點較低，僅20.8℃，化學性質活潑，在持續高溫條件下，2-甲基咪唑會提供堿性環境，堿與乙醛中的α-氫結合，形成一個碳負離子，作為親核試劑，立即進攻另一個乙醛分子中的羰基碳原子，發生加成反應，生成烷氧負離子，再結合一個質子，形成β-羥基醛，β-羥基醛受熱易脫水生成α，β-不飽和醛。故不能采用該方法測定乙醛殘留量。

本研究的目的是建立一種采用氣相色譜檢測2-甲基咪唑中乙醛殘留量的方法。該操作簡單，分析速度快、毒性較小，可以消除樣品對乙醛測定的干擾。該方法根據ICH指導原則進行方法學驗證[17]，具有一定的準確度、精密度和耐用性，從而測定乙醛的殘留量[18]。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 7890B氣相色譜儀（安捷倫，美國）和G4513A自動進樣器（安捷倫，美國），火焰離子檢測器（安捷倫，美國），Metter XS205DV電子天平（梅特勒-托利多，瑞士）。

1.2 試藥 乙腈（色譜純,德國默克），乙醛（無水級，Aladdin，批號 J1709020），2-甲基咪唑（平湖艾泊有限公司，20180120；嘉興艾森有限公司，20171011、20171220、20171220；湖北興銀河化工公司，M-2017101501）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用Aglilent DB-624色譜柱（75 m × 530 μm × 3 μm），液體進樣，進樣量為 2 μL；進樣口溫度為250℃；檢測器溫度為280℃；分流比為 5：1；載氣為 N2；恒流，流速 6 mL·min-1；恒溫：起始溫度50℃，保持5.5 min；后運行：溫度為240℃，保持 10.5 min，流量為 8 mL·min-1。

1.3.2 乙醛殘留量的計算

AS：供試品溶液中乙醛的峰面積；Cs：供試品溶液的溶度（mg·mL-1）

AR：對照品溶液中乙醛的峰面積；CR：對照品溶液的濃度（mg·mL-1）。

1.3.3 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：取2-甲基咪唑適量，精密稱定，用乙腈溶解并定量稀釋成每1 mL含有2-甲基咪唑20 mg，作為供試品溶液。

（2）對照品溶液的制備：取無水級乙醛適量，精密稱定，用乙腈溶解并稀釋成每1 mL含有乙醛400 μg，作為乙醛對照品儲備液。精密吸取0.75 mL乙醛對照品儲備液置于100 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋并制成每1mL含有乙醛3μg，作為對照品溶液。

1.3.4 系統適應性試驗 精密吸取乙醛對照品儲備液2.5 mL，置于10 mL容量瓶中加入乙腈稀釋并定容至刻度；作為系統適應性溶液，按色譜條件連續進樣分析6次，并記錄色譜圖。

1.3.5 專屬性試驗 制備適量濃度的乙二醛溶液、供試品溶液、乙醛對照溶液及純乙腈，分別進樣各分析1次，記錄譜圖。

1.3.6 靈敏度試驗

1.3.6.1 檢出限和定量限：將乙醛對照品儲備溶液逐級稀釋，要求檢出限（LOD,limit of detection）信噪比不小于3，定量限（LOQ,limit of quantity）的信噪比不小于10。

1.3.6.2 檢出限和定量限的重復性：制備乙醛的LOD溶液，按色譜條件進樣分析3次，計算相對標準偏差。

1.3.6.3 定量限的準確度：將6份加入定量限濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進樣分析1次，計算相對標準偏差。

1.3.7 線性關系考察 在定量限至一定的濃度范圍內（包括限度濃度）制備6份濃度不同的乙醛溶液，依次進樣分析3次，以峰面積為縱坐標，乙醛溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數。

1.3.8 精密度試驗 精密度實驗需要進行重復性實驗和中間精密度實驗。

（1）重復性：將6份加入限度濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進樣分析1次，計算回收率。

（2）中間精密度：由不同的實驗人員在不同的時間、不同的儀器，使用不同的試劑，以6份加入限度濃度乙醛的供試品溶液，按色譜條件依次進樣分析1次，分別計算12個供試品溶液回收率。

1.3.9 準確度 將加入80%的限度濃度乙醛、100%限度濃度乙醛、120%限度濃度乙醛的供試品溶液各3份，按色譜條件依次進樣分析1次，計算回收率。

1.3.10 耐用性 將加入限度濃度乙醛的供試品溶

液分別以柱流量為5.5 mL·min-1和6.5 mL·min-1替代6 mL·min-1，其他條件保持不變。以柱溫48℃和52℃替代50℃，其他條件不變以及正常色譜條件下，依次進樣分析兩次，分別計算不同變化條件下的回收率。

1.3.11 穩定性 將對照品溶液、供試品溶液、加入限度溶液的供試品溶液，在25 h內取n（n≥10）個時間點，各溶液分別進行分析1次。分別計算n個對照品溶液中乙醛峰面積和RSD，n個供試品溶液中乙醛峰面積和RSD。

1.3.12 樣品檢測 將限度濃度的乙醛溶液加入5批不同批號的2-甲基咪唑供試品溶液中，每個供試品溶液按色譜條件依次進樣分析1次，計算乙醛殘留量。

2 結果

2.1 系統適應性結果 當采用氣相色譜方法進行檢測或者方法學前，通常是需要確認色譜系統能夠滿足當前的分析要求。這種測試的實質是電路、儀器、樣品和分析操作構成整個系統，需要做一個整體評價。制備新的系統適應性溶液進行測試，結果見表1。

表1 系統適應性試驗結果Tab 1 Results for System Suitability

由表1可知，乙醛峰面積的RSD（n=6）為0.70%＜2.0%，保留時間 RSD（n=6）為 0＜1.0%，拖尾因子＜2.0，理論塔板數＞50 000，符合系統適應性要求。

2.2 專屬性結果 樣品中可能存在其他成分的情況下，所用分析方法能夠準確地、選擇性地檢識被測組分的能力，又稱為選擇性或專一性。主要是考察雜質及其他成分對待檢成分測定結果的影響，通過空白試驗來考察。結果見圖1～3。結果表明空白乙腈對檢測乙醛無干擾，乙二醛、2-甲基咪唑中及其雜質在5.5 min內均無檢出，該方法專屬性良好。

2.3 靈敏度結果 實驗得乙醛的檢出限為0.55 μg·mL-1，定量限為 1.3 μg·mL-1，LOD 三針的保留時間RSD（n=3）=0.022% ＜1.0%；LOQ 六針的保留時間的RSD（n=6）=0.01% ＜ 1.0%，六針峰面積的 RSD（n=6）=1.22%＜6%，均符合要求，證明該方法具有較好的靈敏度。LOQ的6個加樣回收率在100.26～103.14均在藥典規定的回收率限度85%～110%的范圍內，且RSD（n=6）=1.31%小于藥典規定的RSD可接受范圍4%。該方法具有一定的靈敏度。

圖1 空白乙腈GC色譜圖Fig 1 Chromatogram of acetonitrile

圖2 乙醛GC色譜圖Fig 2 Chromatogram of acetaldehyde

圖3 混合溶液GC色譜圖Fig 3 Chromatogram of mixed solution

2.4 線性關系考察結果 由下圖可知，乙醛在1.36～188.96 μg·mL-1內線性關系良好，線性方程為Y=1.916 8X-0.413，截距的絕對值0.413小于100%響應值的25%，線性方程的相關系數＞0.998，且6個響應因子RSD（n=6）＜10.0%。表明其濃度與峰面積有良好的線性關系。

圖4 線性范圍考察結果圖Fig 4 Results for Linearity

2.5 精密度結果 重復性試驗的6個加樣回收率在97.63%～100.08%均在85.0%～110.0%的范圍內，且RSD（n=6）=0.91%小于4.0%。均符合藥典要求。表明該方法重復性良好。12份供試液回收率的RSD(n=12）=1.26%＜4.0%，表明該實驗方法的中間精密度良好。

2.6 準確度結果 由表2可知，3個濃度的9個加樣回收率在99.74%～102.87%均在85.0%～110.0%的范圍內，且9個加樣回收率的RSD（n=9）=1.19%小于4.0%，均符合藥典要求。表明該方法準確度良好。

表2 準確度試驗結果Tab 2 Results for accuracy

2.7 耐用性結果 實驗結果表明，當流速在（6±0.5）mL·min-1變化，6個回收率均在 85.0%～110.0%的范圍內，且6個回收率的RSD（n=6）=0.89%小于2.0%；起始柱溫在（50±2）℃變化，6個回收率均在85.0%～110.0%的范圍內，且 RSD（n=6）=1.97%小于2.0%，證明該方法的耐用性較好。

2.8 穩定性結果 實驗結果表明，樣品供試液在25 h內無乙醛產生；乙醛對照品溶液在25 h內峰面積 RSD（n=13）=1.06%＜4.0%；26個加樣的乙醛回收率在85.0%～110.0%范圍內，峰面積 RSD（n=26）=0.81%＜4.0%，表明樣品溶液、乙醛對照品溶液、加樣溶液在25 h內是穩定的。

2.9 測樣結果 結果表明，5批樣品中乙醛的含量均低于最低檢出限，未能檢出，故5批樣品均合格。

3 討論

3.1 色譜柱的篩選 先后采用極性不同的色譜柱Agilent DB-1（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-624（30 m×0.53 mm×3 μm），Agilent DB-WAX（30 m×0.53 mm×1μm），Agilent-FFAP （60m×530μm×3μm），根據目標峰的保留時間、拖尾因子和理論塔板數及分離度，選擇Agilent DB-624毛細管柱，由于乙醛沸點很低，故采用 Aglilent DB-624（75 m×530 μm×3 μm）毛細管柱增加乙醛的保留。

3.2 柱溫和柱流量的篩選 根據乙醛性質活潑，出峰時間較早，樣品2-甲基咪唑對其測定無干擾，故采用柱溫恒溫，后運行高純氮尾吹的方法，目的是將2-甲基咪唑和高沸點雜質吹出色譜柱。根據目標峰的保留時間、拖尾因子和理論塔板數及分離度，確定柱溫、柱流量。恒溫：起始溫度50℃，保持5.5 min；后運行：溫度為240℃，保持10.5 min，流量為 8 mL·min-1。

本文的目的是開發出一種快速、簡易、環保的采用液體直接進樣方式檢測乙醛殘留量的氣相色譜方法。從最經濟最耐用的非極性毛細管柱到極性毛細管柱進行篩選，從不同的起始柱溫、升溫速率及柱流量進行了色譜條件的優化來確定最佳檢測參數。乙醛溶劑殘留在藥典及ICH中沒有明確的限量要求，通過查閱以往藥品注冊數據、乙醛相關毒理學數據及美國政府工業衛生學家會議推薦接觸限值，確定乙醛的限度為150 ppm。本方法根據ICH分析方法驗證指導原則從系統適應性、專屬性、靈敏度、線性、精密度、準確度、耐用性、溶液穩定性等方面對藥物中間體2-甲基咪唑中乙醛的殘留量進行方法學研究，結果表明該方法專屬性強，靈敏度高，結果準確可靠，具有良好的耐用性和穩定性。