伯氏瘧內質網塑形蛋白SEY1敲除質粒的構建及轉染

劉 影 ，史小雨 ，王 倩

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津300070）

瘧疾（Malaria）是由瘧原蟲（Plasmodium）引起的，以按蚊為主要傳播媒介的全球性寄生蟲病，以非洲地區的發病率和死亡率最高。我國的瘧疾傳染由于滅蚊等努力一度絕跡，但近年來在南方一些省份已顯死灰復燃之勢，且面臨著嚴重耐藥問題[1-3]。目前瘧疾相關研究過多的集中在疫苗和藥物研發，卻忽略了對瘧原蟲生物學機理的探索。

瘧原蟲作為一種真核生物，其致病性及宿主的免疫應答都與瘧原蟲的蛋白質分泌密切相關。瘧原蟲分泌的蛋白不僅嵌入自身質膜，還會進入納蟲泡腔以及宿主細胞的胞漿，甚至還會嵌入宿主細胞的質膜中[4-5]，在細胞黏附、免疫隔離、信號傳遞等多個過程發揮重要作用[6-7]，以創造更利于自身生長發育的環境。因此，研究瘧原蟲蛋白質分泌過程，特別是與蛋白分泌密切相關的細胞器—內質網（endoplasmic reticulum，ER），對探究瘧原蟲的致病機制尤為重要。

內質網是真核生物中最大的膜包被細胞器，由不間斷的片狀和管狀結構組成。內質網參與多種重要細胞活動，均與其形態特征密切相關，特別是蛋白質分泌功能[8]。多個整合膜蛋白家族成員已被發現參與內質網形態的維持，如DP1、Atlastin和RTN等。筆者在前期研究中發現，真核細胞的內質網塑形蛋白（ER-shaping protein）Atlastin，屬于 dynamin超家族的GTP酶，主要通過介導同源膜融合來構建內質網管狀網絡[9-10]，其缺失會減少COP II囊泡的形成，從而影響內質網中合成加工蛋白的運輸[11]，說明內質網正常形態的維持與蛋白質分泌功能密切相關。此前已有研究嘗試觀察紅外期和紅內期瘧原蟲內質網形態[12]，但瘧原蟲內質網的具體功能及其在瘧原蟲致病性方面的作用目前尚無研究。通過瘧原蟲基因組分析，筆者在伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei,P.berghei）中找到哺乳動物Atlastin蛋白的同源蛋白PbSEY1（P.bergheiSEY1）。SEY1 在其他細胞內質網形態和功能維持中很重要，然而，筆者目前并不了解它如何在瘧原蟲中發揮功能，以及這些功能與蛋白質分泌及瘧原蟲致病性之間的關系。

為了探究伯式瘧原蟲內質網塑形蛋白PbSEY1在瘧原蟲寄生及致病過程中的作用，本研究利用敲除-回復載體pL0034，構建pL0034-△PbSey1重組質粒，結合瘧原蟲轉染技術，基于單交換（single crossover）的同源重組（homologous recombination）原理，將PbSey1從瘧原蟲基因組中敲除，構建PbSey1缺失的瘧原蟲突變體，且在后續回復實驗中，該突變體在藥物作用下可直接恢復PbSey1的表達，為探究內質網塑形蛋白PbSey1在瘧原蟲致病性方面的作用提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 伯氏瘧原蟲P.bergheiANKA由羅格斯大學新澤西醫學院Purnima Bhanot教授贈予，大腸桿菌載體pL0034于本實驗室保存（圖1），克隆感受態細胞Mach1-T1購自北京博邁德基因技術有限公司，質粒提取試劑盒購自QIAGEN公司，質粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自TransGen Biotech公司，限制性核酸內切酶EcoRV、NotI、KpnI及T4 DNA連接酶購自ThermoFisher公司，乙胺嘧啶購自Sigma公司，細胞核轉染試劑盒購自Lonza公司。

圖1 pL0034質粒圖譜Fig 1 Plasmid profile of pL0034

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因片段Segment I和Segment II的獲取 以野生型伯氏瘧原蟲PbSey1基因的編碼區（1-2742bp）為模板，分別擴增兩個片段Segment I（S I，26-1059bp）和 Segment II（S II,1050-1958bp），并在兩個片段上下游分別引入KpnI、EcoRV和KpnI、NotI酶切位點（PCR引物見表1）。PCR條件為：94℃預變性 30 s，以 98 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，循環35次，68°C 5 min，4°C終止反應。瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產物片段大小正確后切膠回收，再將片段S II經KpnI、NotI酶切，酶切產物純化后備用。

表1 目的片段PCR擴增引物Tab 1 PCR primers

1.2.2 重組質粒pL0034-△PbSey1的構建 先將片段S II通過酶切位點KpnI和NotI與pL0034在T4 DNA連接酶的催化下16℃連接過夜，次日將連接產物轉化至感受態細胞Mach1-T1中，在含有氨芐的固體培養基上37°C倒置培養12 h，挑取陽性單克隆后搖菌擴增提取質粒。酶切鑒定及DNA測序確認片段S II插入無誤后，利用In-Fusion無縫克隆的方法將片段S I與KpnI和EcoRV雙酶切后的質粒 pL0034-S II連接（條件為 50°C，30 min），將連接產物轉化至感受態細胞后進行氨芐篩選培養，挑取單克隆進行擴增并提取質粒，酶切鑒定及DNA測序確認片段S I插入正確。

1.2.3 瘧原蟲轉染 將液氮中凍存的伯氏瘧原蟲感染血液通過尾靜脈注射感染Wistar大鼠。每日鼠尾取血制備薄血片，Giemsa染色，油鏡觀察并計算蟲血率。待蟲血率升至3%～5%時，心臟取血收集大鼠血液，加入10 mL完全培養基，離心（200 g，8 min），棄去上清后將全部血細胞沉淀轉移至150 mL完全培養基中，充入 5%CO2、5%O2、90%N2混合氣體，于 500 mL 密封錐形瓶中，37°C、77～80 r/min條件下培養16～23 h。次日制備血涂片檢查培養狀況，若80%左右瘧原蟲發育為成熟裂殖體即可進行分離純化。將培養液體分至4個50 mL離心管中，每管35mL，在底部緩慢加入10 mL Nycodenz/PBS溶液（密度梯度溶液），使二者產生明顯界面，離心（200 g，25 min）。離心后在培養基與密度梯度離心液之間形成一個棕色液體薄層，即為裂殖體細胞層，用吸管小心將該層吸出，完全培養基洗滌1次，棄凈上清后置于冰上備用。將 100 μL Nucleofector溶液、10 μg 重組質粒及30 μL分離得到的裂殖體混合電擊后，尾靜脈注入BALB/c小鼠，再經乙胺嘧啶篩選獲得成功轉染的瘧原蟲。

2 結果

2.1 瘧原蟲PbSey1基因敲除及回復策略 以野生型伯氏瘧原蟲Sey1基因編碼區為模板構建的質粒pL0034-△PbSey1，轉染后首先進行第一次同源重組（圖2A），發生重組的同源臂為Segment II，使Sey1因片段缺失及無啟動子而無法表達，即只有發生Segment II重組的瘧原蟲才能產生△Sey1的基因型，同時表達抗藥標簽hDHFR（human dihydrofolate reductase），可在乙胺嘧啶（pyrimethamine）篩選中存活，最終經單克隆篩選即可得到敲除Sey1的瘧原蟲。

獲得PbSey1缺失瘧原蟲突變體后即可觀察其表型并進行相關功能實驗。為了滿足后續回復實驗的需求，本文所使用的基因敲除策略在進行回復實驗時無需重新構建回復質粒，只需在藥物篩選作用下發生第二次單交換的同源重組即可得到PbSey1回補的野生基因型。在5-氟胞嘧啶的作用下，Pb-△Sey1將進行第二次同源重組（圖2B），同源臂為Segment I，重組可導致耐藥標簽hDHFR-yFCU的丟失而PbSey1重新表達。未發生第二次重組的瘧原蟲因含有標簽yFCU（yeast enzyme cytosine deaminase and uridyl phosphoribosyl transferase），可將5-氟胞嘧啶轉化為有毒性的5-氟尿嘧啶而被殺死，由此即可得到PbSey1回補的野生型瘧原蟲。

圖2 瘧原蟲PbSey1基因敲除及回復策略Fig 2 PbSey1 knockout and rescue strategy in Plasmodium

2.2 重組質粒pL0034-△PbSey1的構建和鑒定 由于酶切位點設計的不同，首先擴增和插入的片段是Segment II（909bp）（圖3A）。在其5′端第10位堿基引入一個點突變（T＞C）（圖3C），在不影響其氨基酸編碼的前提下產生酶切位點EcoRV（GATATC），同時在EcoRV（綠色箭頭顯示）的上游引入酶切位點KpnI（藍色箭頭顯示）；在Segment II的3′端引入酶切位點NotI（紅色箭頭顯示）（圖3C）。利用KpnI和NotI兩個酶切位點插入S II即可得到質粒pL0034-S II，酶切鑒定及DNA測序證明插入片段正確（圖3A）。

pL0034-S II構建成功后，擴增、插入片段Segment I（1034 bp）（圖3B）。在S I的5′端引入酶切位點KpnI（藍色箭頭顯示），與S II相同，在3′端的末位堿基引入點突變（T＞C）而產生酶切位點EcoRV（綠色箭頭顯示）（圖3C）。利用In-Fusion無縫克隆方法將S I插入質粒pL0034-S II，即得到質粒pL0034-△PbSey1，KpnI和NotI酶切鑒定及 DNA測序證明插入片段正確（圖3B）。最后經EcoRV酶切將質粒線性化后即可用于瘧原蟲轉染。

圖3 重組質粒pL0034-△PbSey1的構建和鑒定Fig 3 Construction and identification of recombinant plasmid pL0034-△PbSey1

2.3 瘧原蟲轉染及重組子的鑒定 伯氏瘧原蟲經同步化培養后約80%的瘧原蟲均已發育為成熟裂殖體，在此階段進行轉染效率最高。經電轉后的瘧原蟲在小鼠體內生長，每日監測血涂片，100倍油鏡下觀察100個視野，若觀察到瘧原蟲即為陽性，未找到則為陰性。轉染后次日即出現瘧原蟲陽性，于小鼠飲水中加入乙胺嘧啶，給藥2 d后血涂片瘧原蟲轉為陰性，遂撤藥。停藥后第5天瘧原蟲再次轉為陽性，至停藥后第9天蟲血率長至5%，心臟取血純化瘧原蟲，提取基因組DNA，PCR鑒定及PCR產物DNA測序結果提示成功獲得PbSey1缺失瘧原蟲突變體，但為混合克隆，PCR條帶灰度分析顯示PbSey1缺失瘧原蟲突變體約占50%（表2，圖4）。

表2 PCR鑒定PbSey1敲除瘧原蟲引物Tab 2 PCR identification primers of PbSey1-deleted parasites

圖4 瘧原蟲轉染后重組子的鑒定Fig 4 PCR identification of PbSey1-deleted Plasmodium integrants

3 討論

內質網作為真核細胞蛋白質合成、脂質合成和鈣儲存的關鍵細胞器，其結構和功能對真核生物的生存和繁殖極為重要，對于瘧原蟲也是如此。內質網塑形蛋白SEY1通過介導內質網同源膜融合參與管狀網絡結構的形成，若SEY1缺失將會對內質網的形態和功能以及細胞的生長發育造成影響。在哺乳動物中，Atlastin GTP酶（同源蛋白SEY1）的缺失會影響COP II包被囊泡的出芽生長，從而對內質網合成蛋白的運輸產生負作用；人體內Atlastin（ATL）的缺失會造成遺傳性痙攣性截癱（hereditary spastic paraplegia，HSP）[13]；在擬南芥植物，其同源蛋白RHD3（root hair defective 3）的缺失則會影響生長素水平及生長素運輸機制穩態，從而引起植物矮小，根毛變短和卷曲[14]；在果蠅中，ATL缺失會導致其神經元缺陷[15]；在白色念珠菌中，內質網的膜融合延遲甚至片段化則會使其毒力和致病力降低[16]。這些研究結果都為筆者研究PbSEY1在瘧原蟲內質網中的作用提供了依據和方向，促使筆者繼續探究內質網塑形蛋白PbSEY1在瘧原蟲生長和致病過程中的作用。

在瘧原蟲中進行某種蛋白功能研究時，除了敲除該種蛋白外，對敲除株進行蛋白回補也是必不可少的實驗步驟。在本研究中，筆者利用基因同源重組原理及質粒pL0034上藥物篩選標簽hDHFR和yFCU，將基因敲除和基因回復兩個截然相反的實驗目的融合在一個重組質粒中，避免了后期因回復實驗而重復構建質粒及再次進行瘧原蟲轉染[17]。此外，該質粒在進行PbSEY1的基因回復時是在瘧原蟲基因組中PbSEY1的原位進行回復，其表達量仍與野生型瘧原蟲一致，對基因組的其他序列也不會產生影響，確保了回復后瘧原蟲基因組的完整性和準確性。

通過瘧原蟲同步化培養和轉染技術成功在伯氏瘧原蟲中敲除PbSEY1，獲得了PbSEY1缺失瘧原蟲與野生型瘧原蟲的混合克隆。這是由于在乙胺嘧啶藥物篩選過程中少量未發生同源重組的野生型瘧原蟲自發突變，獲得耐藥性而存活下來。對于混合克隆，常規應進行單克隆篩選，但筆者在進行單克隆篩選時卻遇到了重重困難。筆者常規采用稀釋法進行單克隆篩選，即每只小鼠僅尾靜脈注射1個瘧原蟲，經多次嘗試卻始終無法得到PbSEY1缺失的單克隆蟲株。據此，推測PbSEY1與其他物種中的同源蛋白有所不同，可能在瘧原蟲血液階段的生長發育過程中發揮著至關重要的作用，以至于PbSEY1敲除蟲株無法單獨存活，其在瘧原蟲致病性方面的具體作用機制還有待于結合其它分子工具進一步深入研究。

綜上所述，內質網膜塑形蛋白SEY1及其同源蛋白在細胞內有著不可或缺的作用，筆者推測在瘧原蟲體內更是如此。本研究成功構建了PbSEY1敲除-回復重組質粒pL0034-△PbSey1，建立了穩定的瘧原蟲轉染平臺，為后續深入研究SEY1蛋白在瘧原蟲中的具體功能提供了有利工具。