C1QL1蛋白在原發性肝細胞癌中的表達及其臨床意義

胡 源 ，許戈良 ，莢衛東 ，潘婷婷 ，余繼海 ，黃 玫 ，周杭城

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）肝臟外科，合肥230001；3.肝膽胰安徽省重點實驗室，合肥230001；4.中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）病理科，合肥230001）

原發性肝細胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是最常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率在全球惡性腫瘤發病率中位居第5位，死因高居第3位[1]；在我國，本病年死亡率占腫瘤死亡率的第2位；肝癌患者的發病年齡大多為40～50歲，男性比女性多見。肝癌由于其惡性程度高，對放化療不敏感，早診早治（以手術切除為主的綜合治療）是提高肝癌長期治療效果的關鍵所在。

影響肝癌發生、發展及預后的因素是多方面的,C1QL1基因是C1q蛋白質家族的一員，C1QL1是C1q-like的一種小的分泌蛋白，幾乎完全在腦中表達，C1q-like（C1QL）-1、-2、和-3 蛋白質是由在大腦中高度表達的同源基因編碼的，有研究表明目前C1QL1已被發現在結直腸癌中呈過度表達可能被作為結直腸癌預后的一種生物標記[2]，且也有研究表明，C1QL1在分化型甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中存在差異性表達，C1QL1可以作為分化型甲狀腺癌的生物標志物之一，并與CRABP1及LCN2共同預測分化型甲狀腺癌的甲狀腺外擴散[3]，對甲狀腺癌的診斷及預后具有重要的臨床意義，但C1QL1在HCC中的表達及其臨床意義仍有待研究，本研究采用免疫組織化學技術檢測、Western blot檢測及qRT-PCR實驗檢測C1QL1在HCC組織中的表達情況，并探討其高表達與HCC的發生發展、惡性程度及臨床病理關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2006年4月-2011年10月于中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）肝臟外科經病理確診的HCC患者腫瘤組織石蠟切片共80例作為實驗組，相對應的癌旁組織作為對照組。術后均經病理結果證實均為HCC，臨床病歷資料完整且術前患者均未行化療、放療及介入等其他相關輔助治療。男性患者55例，女性患者25例，年齡20～74歲；HBsAg陽性患者44例，陰性患者36例；有血管侵犯（鏡下癌栓或肉眼癌栓）45例，無血管侵犯35例；腫瘤的TNM分期標準采用美國癌癥聯合會（AJCC）第八版標準[4]，I～II期者 46 例，III～IV 期者34例；腫瘤分級標準采用Edmondson分級法，其中Ⅰ～Ⅱ級53例，Ⅲ～Ⅳ級27例。另外收集2017年10月—2018年4月于中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）肝臟外科行HCC切除術的新鮮冷凍HCC組織及其相對應的癌旁組織共20對，將標本放置-80℃冰箱冷凍保存，行Western blot及qRT-PCR實驗檢測。所選患者術后均未行放療、化療、介入等其他輔助治療。

1.2 主要試劑 C1QL1抗體（美國SIGMA公司）；通用山羊抗鼠/兔二抗PV-6000（北京中杉金橋公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；蘇木素染色劑（珠海貝索生物技術有限公司）；SP試劑盒（北京中杉金橋公司）；BCA試劑盒（上海碧云天生物公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色 所有常規石蠟包埋的組織，4 μm連續切片后，進一步做免疫組織化學染色。（1）將石蠟切片于60℃烤箱烘烤20 min于2次二甲苯溶液分別浸泡10 min，以充分脫蠟；再分別于 100%、95%、75%的梯度乙醇浸泡 5 min；（2）自來水沖洗浸泡5 min后放入檸檬酸鹽緩沖液中，用高壓鍋煮沸修復抗原，3%H2O2孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；（3）PBS緩沖液沖洗后滴加兔抗人C1QL1（1：50）特異性抗體，放置 4 ℃冰箱孵育過夜；（4）次日PBS緩沖液沖洗后滴加二抗于37℃孵育30 min；（5）PBS緩沖液沖洗后DAB顯色劑進行顯色；滴加蘇木素復染，再分別于75%、95%、100%梯度的乙醇溶液浸泡2 min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.2 免疫組化染色結果評分標準 （1）根據陽性細胞所占比例進行評分[5]：C1QL1蛋白主要定位于細胞質，少數表達于細胞核，在組織切片中胞質染為高于背景的淡黃、黃色、棕黃色者為陽性反應細胞。每張切片隨機選擇5個400倍視野，每個視野計數100個細胞，得出陽性細胞百分比并賦分：＜10%陽性細胞為0分，11%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分；（2）另外根據染色細胞強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。每張切片最終分數為上述兩種評分的乘積（即著色細胞所占百分比分數×著色細胞強度），分數≥5分定為高表達，得分＜5分定為低表達。以上結果均由同一位病理專科醫師獨立閱片并評分。

1.3.3 Western blot檢測 分別將收集的HCC與癌旁組織樣本進行充分裂解，并采用BCA法進行總蛋白濃度的測定，將每對蛋白樣本進行等量上樣，上樣量為50 μL，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉至PVDF膜上，脫脂奶粉搖床上室溫封閉1 h，加入 C1QL1一抗（1：500），4℃孵育過夜,TBST洗膜3次，洗滌后加入二抗（1：10 000），室溫下搖床孵育2 h，TBST洗滌后顯色、定影，使用Alpha-Ease FC成像系統（Alpha Innotech，美國）觀察。并對C1QL1蛋白與內參蛋白灰度值進行分析，然后計算目標蛋白和內參蛋白灰度值的比值用于分析C1QL1蛋白表達水平。

1.3.4 qRT-PCR實驗檢測 使用TRIzol試劑盒對HCC及相對應癌旁組織的總RNA進行提取，經逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR反應：首先95℃預變性10 min；95℃變性10 s后60℃退火1 min；共40個循環，所有樣本基因均進行3次重復。C1QL1引物正向序列：5′-GGG TTA CGA GGT ACT CAA GTT TG-3′，反向序列：5′-AAA GTA GGT GCC GGG AAT GTT-3′；內參設置為 ACTIN，正向序列：5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′，反向序列 5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′，表達水平使用 2-ΔΔCt進行計算。

1.4 臨床病理指標 腫瘤的早期復發認為是手術切除腫瘤后2年內復查發現肝內出現復發灶或者肝外轉移灶。腫瘤大小選取腫瘤最大直徑；血管侵犯是指鏡下癌栓或肉眼癌栓；腫瘤包膜的完整性是指腫瘤組織的切面與周圍正常組織是否分界清楚[6]；肝癌TNM分期標準依據美國癌癥聯合會（AJCC）第8版標準[4]；腫瘤分級標準采用Edmondson分級法[7]。1.5 統計學處理使用 SPSS24.0軟件及Graph-Prism5.0軟件對數據進行統計學分析，本研究中所涉及的分類變量通過χ2檢驗或Fisher精確概率算法檢驗；通過Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線；定量資料以±s表示，使用t檢驗方法進行比較分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C1QL1在HCC及癌旁組織中的表達 C1QL1主要表達于HCC細胞質中（圖1），高表達定義為胞質內有黃色或棕黃色顆粒，而間質細胞無染色情況。經過統計分析表明，C1QL1在HCC中的陽性高表達率明顯高于癌旁組織，組間差異有統計學意義（P＜0.05，表 1）。

圖1 HCC組織和癌旁組織中C1QL1表達情況Fig 1 Expression of C1QL1 in HCC tissues and paracancer tissues

表1 C1QL1蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達（n）Tab 1 Expressions of C1QL1 protein in cancer and paracancer tissues（n）

2.2 C1QL1的表達與HCC臨床病理特征的關系C1QL1高表達與患者有無乙肝病史（P=0.021）、腫瘤的大小（P=0.003）、血管侵犯（P=0.003）、TNM 分期（P=0.002）及 Edmondson分級（P=0.002）相關，而與年齡（P=0.758）、性別（P=0.672）、甲胎蛋白（AFP）（P=0.191）、腫瘤數目（P=0.877）、Child-Pugh分級（P=0.866）、腫瘤包膜完整程度（P=0.238）和肝硬化程度（P=0.316）均無關（表 2）。

表2 HCC組織中C1QL1的表達與臨床病理特征的關系Tab 2 Relationship between the expressions of C1QL1 in HCC tissues and clinicopathological features

2.3 C1QL1的表達與肝細胞癌患者生存時間的關系 80例HCC患者中C1QL1高表達者者55例，低表達者25例，失訪8例患者（其中5例失訪者為C1QL1高表達者，3例為 C1QL1低表達者）。Kaplan-Meier生存分析顯示高表達者的中位生存期為17個月，低表達者的中位生存期33個月，經Log-Rank檢驗顯示，C1QL1蛋白高表達患者組與低表達患者組生存率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2。

圖2 肝細胞癌中C1QL1高表達、低表達患者的生存曲線Fig 2 Survival curve of patients with high and low expression of C1QL1 in hepatocellular carcinoma

2.4 Western blot檢測結果 結果顯示（圖3），20對標本中16（80%）對C1QL1在HCC組織中的蛋白表達水平明顯高于相對應的癌旁組織。C1QL1蛋白在HCC組織中的相對表達量為1.24±0.05，癌旁組織中的相對表達量為0.61±0.04，差異具有統計學意義（t=10.17，P＜0.001）。

圖3 Western blot檢測癌組織和癌旁組織中C1QL1表達情況Fig 3 Western blot was used to detect the expression of C1QL1 in HCC tissues and paracancer tissues

2.5 qRT-PCR檢測C1QL1的結果 結果顯示（圖4），20對標本中17對（85%）C1QL1在HCC組織中的mRNA表達顯著高于相對應的癌旁組織（圖3）。C1QL1在HCC組織中的mRNA相對表達量為8.62±0.72，癌旁組織中的mRNA相對表達量為3.03±0.34，差異具有統計學意義（t=6.990，P＜0.001）。

圖4 qRT-PCR分析癌組織及癌旁組織中C1QL1 mRNA的相對表達量Fig 4 The relative expressions of C1QL1 mRNAin HCC tissues and paracancer tissues analyzed by qRT-PCR

3 討論

HCC是最常見的消化系統惡性腫瘤之一[1]，嚴重危害人類健康。在我國，HCC每年發病患者數多達30多萬，占世界肝癌患者總數的60%[8]，其發病率及死亡率均位于所有腫瘤的前列[9]，且肝癌的發生、發展是眾多因素共同參與調節的過程，目前仍然缺乏高敏感性的早期診斷方法，多數患者就診時已為中晚期，所以其治愈率及遠期生存率很低，預后極差[10]，因此探討發現肝癌的生物標志物對肝癌的早期診斷是非常有意義的。

已有研究表明，C1q-like（C1QL）-1、-2 和-3蛋白質是由在大腦中高度表達的同源基因編碼的，明確了C1QL1、C1QL2和C1QL3的球狀C1q域的高分辨率晶體結構，其每一種結構都是一個三聚體，每一個原聚體都形成一個由10股β鏈組成的卷餅折疊樣結構。此外，C1QL的三聚體可以組裝成與脂聯素相似的高階寡聚物，其三聚對稱軸上包含4個Ca2+結合點，以及額外的表面結合位點。Ca2+在三聚對稱軸上的配位殘基降低了Ca2+的結合力和蛋白質穩定性。其研究結果揭示了C1q/TNF超家族蛋白中C1QLs的獨特結構特征，這些蛋白質可能與其大腦的特定功能有關[11]。C1QL1基因最初被克隆為一種與衰老相關的基因，這種基因在大腦中被高度表達，也可能在神經元分化中發揮作用[12],C1QL1基因是C1q蛋白質家族的一員，它是由攀緣纖維（CFs）提供的，在小鼠小腦的整個發育期和成年期，它是一個至關重要的傳導信號。C1QL1能與大腦特定的血管生成抑制劑3（brain-specific angiogenesis inhibitor3，Bai3）（Bai3是細胞粘附的G蛋白偶聯受體家族的成員）特異性結合，并在突觸后的浦肯野細胞上表達[13-14]。此前已經證明[15]，C1QL1與它的受體結合，即粘附G蛋白偶聯受體3，控制了攀附體和浦肯野細胞之間的突觸連接和調節成熟的模式[2，14]。目前C1QL1已被發現在結直腸癌中呈過度表達可能被作為結直腸癌預后的一種生物標記，且也有研究表明，C1QL1在分化型甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中存在差異性表達，C1QL1可以作為分化型甲狀腺癌的生物標志物之一，并與CRABP1及LCN2共同預測分化型甲狀腺癌的甲狀腺外擴散[3]，對甲狀腺癌的診斷及預后具有重要的臨床意義，C1QL1的高表達與HCC的發生發展、惡性程度、生物學行為的確切機制尚未明確，它在HCC中的表達及其臨床意義仍有待研究。

本實驗在C1QL1現有的研究基礎之上，初步探討分析了C1QL1在HCC組織及癌旁組織中的表達情況，以及是否存在差異性表達，并分析其是否與臨床病理相關特征具有密切相關性。研究結果顯示C1QL1在HCC中與癌旁組織中表達具有差異，同樣與HCC患者有無乙肝病史（P=0.021）、腫瘤的大小（P=0.003）、血管侵犯（P=0.003）、TNM 分期（P=0.002）及 Edmondson分級（P=0.002）相關，而與年齡（P=0.758）、性別（P=0.672）、甲胎蛋白（AFP）（P=0.191）、腫瘤數目（P=0.877）、Child-Pugh分級（P=0.866）、腫瘤包膜完整程度（P=0.238）和肝硬化程度（P=0.316）均不相關，表明C1QL1蛋白可能在HCC的發生發展及惡性程度中起到正性上調作用，提示C1QL1蛋白的高表達可能與HCC的發生發展及惡性程度有關。

必須承認的是，本研究樣本量相對較小，且缺乏C1QL1在HCC細胞系中的表達水平以及體外動物實驗的驗證，目前C1QL1在HCC發生發展中作用的具體機制尚未完全明確，更大樣本更深入地研究C1QL1在HCC中的作用機制是非常有必要的。總之，HCC作為一種惡性程度極高、侵襲轉移能力極強及預后較差的消化道惡性腫瘤，發現時常常已是晚期，失去手術機會，導致患者生活質量較差，且生存時間較短，本研究提示了C1QL1在HCC組織中表達的上調可能與HCC發生發展、腫瘤的惡性程度密切相關，并有可能成為HCC早期診斷的生物標志物以及臨床分子靶向治療的新靶點。