扳機日血清孕酮升高在不同卵巢反應人群中與優胚率的相關性分析

曹 穎 ，劉 嬌 ，張云山

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市中心婦產科醫院生殖醫學中心，天津300100）

在使用GnRH類似物之前，控制性卵巢刺激（COS）的晚卵泡期經常出現早發性黃體生成素（LH）峰，以致孕酮（P）過早升高，這種現象稱之為“過早黃素化”（premature luteinization，PL）[1]。隨著 GnRH-a 和GnRH拮抗劑（GnRH-A）的應用，其對垂體的抑制作用顯著降低了PL的發生[2]。然而，盡管在COS過程中使用GnRH類似物，晚卵泡期孕酮仍然升高，發生率為38%[3-4]。不同于PL，血清孕酮提早升高（premature progesterone rise，PPR）是指在IVF周期不存在LH升高的情況下，孕酮在hCG扳機日升高[5]。COS過程中卵泡期PPR的發生機制及其對輔助生殖技術（ART）結局的影響是研究的熱點問題[6-7]。

胚胎的成功植入需要容受性子宮內膜和同步發育的囊胚期胚胎[8]。當晚卵泡期血清孕酮升高時，新鮮周期移植的胚胎種植率和妊娠率均顯著降低[7,9]。這種現象的原因仍存在爭議：胚胎的發育潛能低下、子宮內膜的容受性下降[10]。許多研究報道了孕酮升高對新鮮周期子宮內膜環境有不利影響[11-14]。相反，大多數現有文獻都沒有提出孕酮升高對胚胎的質量和潛能有任何有害影響[5,15-16]。于是，本研究試圖通過大樣本回顧性分析，研究孕酮升高對胚胎質量的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2012年1月-2018年4月在天津市中心婦產科醫院接受IVF-EF治療的不孕癥患者。納入標準：常規GnRH-a長方案，hCG扳機日抽血檢測血清孕酮值，取卵后第3天至少有一個2PN來源的胚胎。排除標準：年齡＞40，胚胎植入前遺傳學診斷（PGD），卵巢低反應（獲卵數＜4個）[17]，因男方因素不孕而行ICSI的夫婦。根據獲卵數是否超過15個分為卵巢高反應組和卵巢正常反應組。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性卵巢刺激方案 所有患者均在月經第2～3天抽查性激素及陰道B超數竇卵泡數（AFC），了解卵巢儲備功能。于月經第21天行陰道B超，確認卵巢和子宮狀態正常，隨即開始降調節。通過注射GnRH-a（達必佳，0.1 mg/支，輝凌制藥，德國）0.05 mg每日1次抑制垂體功能，用藥10 d后抽查血LH、E2及陰道B超。月經第3～5天，當患者達到降調節標準后，根據患者體質量指數（BMI）、卵巢儲備等情況開始給予促性腺激素（Gn）150～300 U促排。Gn采用注射用重組人促卵泡激素（果納芬，75 IU，默克，美國）和/或重組促卵泡素β注射液（普麗康，100 IU，歐加農，荷蘭）和/或注射用尿促卵泡素（麗申寶，75 IU，珠海麗珠，中國）。用藥5天后，根據卵巢反應調整Gn用量。當兩個優勢卵泡達到平均直徑18 mm時，給予hCG 4 000-10 000 U（珠海麗珠）扳機以誘發排卵。在扳機后34～36 h經陰道超聲引導下穿刺取卵。

1.2.2 血清性激素水平測定 收集月經第2～3天和扳機日的血液樣本，采用法國VIDAS全自動熒光免疫分析儀測量血清FSH、P和E2水平。

1.2.3 體外受精-胚胎培養 在禁欲3～5 d后通過手淫將精液收集在無菌容器中，然后在37℃環境中存放30 min。液化后，根據世界衛生組織標準[18]分析樣本的精子濃度、活力和形態，并采用單層密度梯度法或上游法處理精液。將卵母細胞在G-IVF培養基（Vitrolife）中溫育并在取卵后3～4 h受精，受精方式取決于男方精液情況或既往受精情況選擇IVF或ICSI。受精后16～18 h觀察受精情況，正常受精被定義為具有兩個原核（2PN）的受精卵。然后，受精卵在G1培養基中連續培養。取卵后第3天移植不多于兩個最優質胚胎，將剩余可移植的胚胎和全胚凍患者的胚胎冷凍保存，用于隨后的FET周期。

1.2.4 胚胎質量評分 在第3天根據本中心胚胎評分標準[19-20]評估所有可移植胚胎的卵裂球數量、形狀和細胞質碎片。卵裂球內無碎片，卵裂球大小均等，形狀規則被評為I級胚胎。卵裂球內無碎片，卵裂球大小欠均等，形狀欠規則或碎片＜10%，卵裂球大小均等，形狀規則被評為Ⅰ＋級胚胎。將取卵后第3天Ⅰ或Ⅰ＋級、6≤卵裂球數≤10的胚胎及致密融合的正常受精胚胎定義為優質胚胎。

1.3 評價指標 該研究的主要結果是每個受精卵（2PN）來源的優質胚胎率（%）。

1.4 統計學分析 所有數據分析均使用SPSS 19.0版（SPSS Inc.，USA）進行。使用單因素和多因素線性回歸分析來研究IVF/ICSI周期中與優質胚胎形成率相關的因素，并且計算Beta（B）相關系數和95%置信區間（CI）。為避免假設HCG日孕酮水平與優胚率呈線性關聯所造成的潛在偏倚，根據hCG扳機日血清孕酮水平將患者分成≤0.9，0.9～1.2，1.2～1.5，1.5～1.8，1.8～2.1，2.1～2.4，＞2.4 ng/mL 共 7 組，并利用非參數統計的Kruskall-Wallis檢驗分析組間優胚率是否存在差異。使用非參數檢驗（Mann-WhitneyU檢驗）分析組間數據。所有的假設檢驗都是雙側的，P＜0.05被認為是統計學有意義。

2 結果

2.1 患者一般資料 本研究共納入5 097個IVF/ICSI周期。參與者的平均年齡為31歲（范圍20～40歲）。不孕癥的臨床適應癥包括輸卵管因素、卵巢因素、子宮內膜異位癥、男性因素和其它不孕因素。表1列出了所有周期的臨床特征和結局。

表1 IVF/ICSI周期的臨床特征和結局Tab 1 Clinical features and outcomes for the IVF/ICSI cycle

2.2 總體結果 hCG扳機的血清孕酮平均水平為(1.11±0.52)ng/mL。當參與者根據卵巢反應性分組時，卵巢高反應組血清孕酮水平顯著高于卵巢正常反應組[分別為（1.23±0.55）ng/mL，（0.99±0.46）ng/mL；P＜0.001）] 。

圖1 IVF/ICSI周期扳機日血清孕酮值與優胚率之間的關系Fig 1 Relationship between serum progesterone value on the day of hCG administration and excellent embryo rate in IVF/ICSI cycle

在新鮮IVF/ICSI周期，與優胚率有關因素進行單因素和多因素線性回歸分析，扳機日孕酮值與優胚率成負相關（B：-2.016，95%CI：-3.380～-0.653，P=0.004）。圖1顯示了扳機日血清孕酮水平與優胚率之間的關系，即在新鮮IVF/ICSI周期，隨著血清孕酮濃度的逐漸增加，優胚率進行性下降。

2.3 不同卵巢反應組扳機日血清孕酮值與優胚率之間的關系

2.3.1 卵巢高反應組 與優胚率有關因素的相關分析（表2）表明，優胚率與年齡、BMI、不孕時間、基礎FSH、Gn天數、扳機日E2值、獲卵數無顯著相關性。相比之下，優胚率與Gn用量、扳機日孕酮值和受精率顯著相關。

表2 卵巢高反應組與優胚率有關因素的相關性分析Tab 2 Correlation analysis between factors and excellent embryo rate in high ovarian response group

圖2 卵巢高反應組扳機日血清孕酮值與優胚率之間的關系Fig 2 Relationship between serum progesterone value and excellent embryo rate in high ovarian response group

圖2 顯示了卵巢高反應組（n=2 582）扳機日血清孕酮值與優胚率之間的關系。在IVF/ICSI周期，優胚率隨著血清孕酮濃度的增加而逐漸下降。當扳機日血清孕酮值處在 1.8～2.1、2.1～2.4、＞2.4 ng/mL 時，優胚率均顯著低于（P＜0.05）扳機日孕酮值≤0.9ng/mL。然后以扳機日孕酮值1.5、1.8、2.1 ng/mL為界分成兩組，只有以1.8 ng/mL分組時優胚率差異有統計學意義（P＜0.05）（圖 3）。所以，對于高反應人群來說，扳機日血清孕酮值1.8 ng/mL可能就是優胚率發生急劇下降的閾值。

圖3 卵巢高反應組兩組優胚率的比較Fig 3 Comparison of the rate of excellent embryos between the two groups in high ovarian response

2.3.2 卵巢正常反應組 在IVF/ICSI周期進行與優胚率有關因素的相關性分析（表3），結果表明優胚率與Gn用量、扳機日孕酮值水平和受精率顯著相關，而與年齡、不孕時間、BMI、基礎 FSH、Gn 天數、扳機日E2值和獲卵數無顯著相關性。

隨著血清孕酮濃度的逐漸增加卵巢正常反應組（n=2515）優胚率進行性下降（圖4）。當扳機日血清孕酮值＞1.5 ng/mL時，每組優胚率均顯著低于（P＜0.05）扳機日孕酮值≤0.9 ng/mL。同理，以扳機日孕酮值1.2、1.5、1.8 ng/mL為界分成兩組，比較兩組優胚率，只有以1.5 ng/mL分組時差異有顯著性（P＜0.05）（圖 5）。所以，在正常反應人群，扳機日血清孕酮值1.5 ng/mL可能就是優胚率顯著下降的閾值。

表3 卵巢正常反應組與優胚率有關因素的相關性分析Tab 3 Correlation analysis between factors and excellent embryo rate in normal ovarian response group

圖4 卵巢正常反應組扳機日血清孕酮值與優胚率之間的關系Fig 4 Relationship between serum progesterone value and excellent embryo rate in normal ovarian response group

圖5 卵巢正常反應組兩組優胚率的比較Fig 5 Comparison of the rate of excellent embryos between the two groups in normal ovarian response

3 討論

這項超過5 000例IVF/ICSI周期的回顧性研究顯示，不管卵巢反應性如何，hCG扳機日血清孕酮水平升高與優胚率進行性下降相關。卵巢反應性不同，優胚率顯著下降時的血清孕酮閾值濃度不同：我們建議在hCG扳機日血清孕酮水平為1.5 ng/mL作為卵巢正常反應的閾值；在卵巢高反應人群，當血清孕酮水平＞1.8 ng/mL，優胚率顯著下降。這些發現意味著孕酮閾值濃度的升高與卵巢反應性增加有關。

雖然孕酮升高對胚胎質量的影響還有待進一步證實，但已有動物研究發現了孕酮介導的對卵母細胞潛能的調節[21-22]。胚胎質量的這些差異是否導致著床率和妊娠率的降低值得進一步探究。事實上，以前的研究表明，新鮮周期扳機日孕酮升高采取全胚凍方法（freeze-all strategy），隨后進行凍融胚胎移植也能獲得較好的妊娠率和活產率[7,23]，提示PPR的主要不利影響是新鮮周期子宮內膜容受性。然而，已發表的研究主要關注第一次凍融胚胎移植的妊娠率，而不是累積妊娠率[7]。因此，PPR對所有胚胎是否有潛在不利影響還有待研究。最近，一些大樣本回顧性研究發現，高質量胚胎形成率和高質量囊胚形成率與扳機日孕酮升高成負相關，而與女性的年齡、基礎FSH、促性腺激素的總劑量和卵巢刺激時間無關[24-25]。有研究發現反復IVF失敗的女性更容易發生PPR[26]，間接表明hCG扳機日孕酮升高可能與卵母細胞因素有關。此外，一些回顧性研究發現孕酮水平升高對累積妊娠率或累計活產率有不利影響[27-28]。雖然以前有少量研究專注于胚胎質量，但納入研究的患者過少，不能排除偏倚的存在和檢驗效能不足的影響。本文通過大樣本數據回顧性分析，進一步有力地支持扳機日孕酮升高不利于胚胎質量。

對子宮內膜容受性產生不利影響的晚卵泡期孕酮閾值濃度為1.5 ng/mL[11]，與卵巢反應性無關。然而，PPR對新鮮周期妊娠率的影響與卵巢反應性有關[29]。在卵巢高反應人群，新鮮周期妊娠率顯著下降時的扳機日孕酮值水平高于卵巢正常反應和低反應人群[30-31]。眾所周知，胚胎質量與IVF/ICSI周期結局直接相關。因此，筆者認為高孕酮水平通過影響胚胎從而降低妊娠率，而且卵巢反應性不同，優胚率顯著下降時的血清孕酮閾值濃度不同。

綜上所述，雖然全胚凍能夠避開孕酮升高所帶來的子宮內膜容受性降低的影響，但并不能消除對胚胎質量的影響。所以，我們并不建議試圖通過大劑量FSH刺激卵巢和/或延長促排時間一次性獲取最多數量的卵泡。實際上，這可能會增加孕酮升高的機會。減少Gn用量或采用逐步減量法（stepdown protocol）能否減少扳機日孕酮升高的發生而不影響妊娠率，這還有待進一步的驗證[27]。

總之，本研究表明，優胚率的減少與扳機日孕酮升高有關。在卵巢高反應人群，優胚率顯著降低時的孕酮值為1.8 ng/mL；在卵巢正常反應人群，該孕酮值為1.5 ng/mL。